美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性分析
作者：张成桂，何正春，焦春香，刘光明
【摘要】 目的研究从美洲大蠊中提取的抗癌活性成分的体外抗氧化活性，并对其组成进行了初步分析。方法采用体外化学模拟体系研究了美洲大蠊抗癌活性成分体外抗氧化活性，经过SDS-PAGE分析和采用Folin-酚法测定对抗癌活性成分的组成进行初步分析。结果美洲大蠊中抗癌活性成分在清除二苯基苦味肼基自由基（DPPH·）和·OH自由基的效果和总还原能力均表现出不同程度的量效依赖关系；清除DPPH·自由基能力的EC50值为0.309 mg/ml ；清除·OH自由基的EC50 值为8.776 mg/ml；抗癌活性成分还原力的EC50为1.103 mg/ml；经过SDS-PAGE分析呈现的抗癌活性成分组成主要由一系列小分子多肽组成的混合物，小分子多肽在抗癌活性成分中的含量为62.7 %。结论美洲大蠊中抗癌活性成分具有抗氧化活性，其活性弱于Vc，其活性与浓度呈正相关性，其组成成分中多肽成分占有62.7 %的比例。
【关键词】 美洲大蠊； 抗癌活性成分； 抗氧化活性； 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
我国传统中药经常使用昆虫作为一种配方而直接入药，或用提取物开发了许多新药剂，蟑螂就是一个十分典型的药用昆虫的例子。蟑螂，学名蜚蠊，书蜚蠊目昆虫。在《神农本草》《名医别录》《唐本草》《本草纲目》和《本草纲目拾遗》等药典中对蜚蠊均有专条记载。目前，已经利用美洲大蠊分离出了抗病毒、强心等活性成分，制成能增强免疫的创面修复剂“康复新液”，治疗乙型肝炎新药“肝龙胶囊”和治疗心力衰竭新药“心脉隆注射液”。随着研究工作的展开，有研究发现大蠊提取的抗菌肽直接杀灭细菌，其机理是抗菌肽作用于细菌的外层，造成外层凹陷、穿孔，导致内容物外泄，最后菌体崩解的作用方式［1］。另外，关于蟑螂油、美洲大蠊提取物AT-2的抗癌作用也有相关的研究报道［2，3］。本实验对采取新工艺提取的活性成分（该活性成分具有明显的细胞毒性和体内抗肿瘤功效，可以用于制备治疗鼻咽癌和口腔上皮癌等肿瘤的药物或保健品，并已经申请了专利）进行体外抗氧化活性及组成性成分进行初步的实验分析，为美洲大蠊抗癌活性成分的进一步深度开发利用提供参考依据。
1 材料与仪器
1.1 材料美洲大蠊Periplaneta americana L.抗癌活性成分由大理学院药学院昆虫药物研究实验室提供，由蜚蠊科虫体鲜品或干品经醇水提取、大孔吸附树脂柱层析、醇溶剂洗脱精制而成［申请(专利)号：200810059054.X］，保存于4℃冰箱中备用。
1.2 试剂、药品和仪器无水乙醇、H2O2、硫酸亚铁、水杨酸、冰乙酸、亚油酸、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、 三羟甲基氨基甲烷、HCl、DPPH(2,2 -二苯基-1-苦基苯肼) 、Vc、等均为分析纯。Ultra-spec2100紫外可见分光光度计(Amersham Biosciences)、超声波破碎仪(SONISS公司)、RE-52CS1旋转蒸发器(上海亚荣)等。
2 方法
2.1 抗氧化活性分析
2.1.1 清除DPPH·活性的测定清除DPPH·活性的测定参照Kim等［4］的方法：二苯基苦味肼基自由基(DPPH·)是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517 nm波长处有最大吸收。DPPH乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。在DPPH乙醇溶液中加入抗氧化剂后，抗氧化剂可以与DPPH·结合或发生替代，使DPPH·数量减少，溶液颜色变浅，在517 nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。因此，可以在517 nm 波长处检测抗氧化剂对DPPH·自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。 首先配制0.2 mmol·L-1无水乙醇溶液的DPPH：准确称取4.4 mg DPPH粉末，用无水乙醇溶解并定容于50 ml容量瓶中，摇匀，该试剂现配现用。取不同浓度的样品溶液各4 ml，再加0.2 mmol·L -1DPPH 2 ml溶液。室温黑暗放置30 min后，用相应的溶剂做参比，在517 nm可见光波长测定吸光值分别为A空白和A样品。
根据公式计算样品清除率I(%)=(A空白-A样品)/ A空白×100%；Acontrol =2 ml DPPH溶液+4 ml无水乙醇的吸光度；Asample =4 ml样品溶液+2 ml DPPH溶液的吸光度；Ablank = 4 ml样品溶液+2 ml无水乙醇的吸光度。以维生素C作对照比较。抗癌活性成分在自由基清除率为50 %时所消耗的剂量，可以用内插法在相应的清除率和浓度的曲线上将相应的值计算出来，计算所得即为EC50。
2.1.2 对·OH自由基的清除率测定清除羟基自由基的测定参照文献［5］的方法。利用 H2O2与 Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。该产物在510 nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而使有色产物生成量减少。 以2.0 mmol·L-1 FeSO4∶1.0 mmol·L-1 H2O2∶6.0 mmol·L-1水杨酸=1∶1∶1的比例依次加入到烧杯中，振荡摇匀，配制300 ml。于37 ℃水浴温浴15 min。取10 ml试管，每支都加入上述5.0 ml溶液，然后分别加入含不同浓度的样品溶液1.0 ml，摇匀，继续于37 ℃水浴加热15 min，待加热完毕后以超纯水调零，应用紫外分光光度计于510 nm处测定吸光度Ai, 不加样品只加超纯水的试管检测吸光度值为A0。以维生素C作对照比较。根据下式计算抗癌活性肽成分对·OH 的清除率：·OH 清除率( %)＝(A0-Ai) /A0×100。清除·OH自由基的EC50 值的计算同上。
2.1.3 还原能力的测定还原能力的测定参照文献［6］的方法。取不同浓度的样品溶液各2.5 ml，再分别加入2.5 ml的0.2 mol·L-1，pH 6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 ml 1 %的K3Fe(CN)6溶液，混匀后于50 ℃保温20 min后再加入2.5 ml 10 %的三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r·min-1离心10 min。取上清液5 ml，加5 ml 蒸馏水和l ml 0.1 %的FeCl3，混合均匀，10 min后测定700 nm处的吸光度，以80 %甲醇为参比。吸光值越大表示还原能力越强。 抗癌活性成分在700 nm处的吸光度为0.5时的浓度，可以通过内插法将各成分不同浓度在700 nm处的吸光度与浓度的曲线上将相应的值计算出来，计算得到即为EC50。
2.2 抗癌活性成分分析SDS-PAGE电泳：配制15 %分离胶和6 %浓缩胶，样品电泳结束后，凝胶用硝酸银染色。
3 结果
3.1 抗癌活性成分对DPPH·的清除效果抗癌活性成分表现出较好的清除DPPH·自由基的能力，如图1(a)所示，抗癌活性成分呈现出明显的剂量依赖性关系，随抗癌活性成分浓度的增加表现为对DPPH·自由基清除率也增加，二者呈现为线性相关性，浓度与清除率的相关系数R2=0.995 4，线性范围0.045～0.45 mg·ml-1；但是相对于维生素C来说，维生素C清除DPPH·自由基的能力显著强于抗癌活性成分，如表1(b)所示。抗癌活性成分的EC50为 0.309 mg·ml-1，而维生素C的EC50为 0.005 mg·ml-1。