酶解法提取长春花中长春碱、长春质碱、文多林

来源:岁月联盟 作者: 时间:2015-05-19

                 作者:何际婵, 董志超, 王建荣, 晏小霞

【摘要】    目的研究纤维素酶法提取长春花中长春碱、长春质碱和文多林的最佳工艺。方法采用HPLC法测定长春碱、长春质碱和文多林的含量,通过单因素实验考察酶解温度、pH、酶解时间、加酶量、浸提倍数对长春碱、长春质碱和文多林提取率的影响。结果实验得出纤维素酶解长春花的最佳工艺为:温度40℃,pH 1.5,时间12 h,浸提倍数20,加酶量2 mg/g长春花。结论酶解法较酸水浸提法更有利于长春碱、长春质碱、文多林的提取。

【关键词】  长春花; 长春碱; 长春质碱; 文多林; 纤维素酶

  Abstract:ObjectiveTo study the optimal enzymatic extraction of vinblastine, catharanthine and vindoline from Catharanthus roseus (Linnaeus) G. Don.MethodsHPLC method was used to determine the contents of vinblastine, catharanthine and vindoline from C. roseus.Five factors were studied during enzymatic extraction of cellulase.ResultsThe optimal enzymatic extraction of cellulase was determined as follows: enzyme 2 mg for 1 g material, Ph1.5, buffer to raw material ratio 20, temperature 40℃, and enzymolysis time 12 hours.ConclusionCompared with the traditional acidic water extraction, the enzymolysis method can increase the extraction yield of effective components from C. roseus.

  Key words:Catharanthus roseus;  Vinblastine;  Catharanthine;  Vindoline;  Enzymatic cellulose
   
  长春花Catharanthus roseus (Linnaeus) G. Don是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属(Catharanthus roseus G. Don)一种重要的药用植物。长春花中含有大量的生物碱,长春碱(Vinblastine)是其中最重要的一种。长春碱在临床上主要用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肉瘤、急性白血病和绒毛上皮癌等[1,2]。而长春质碱(Catharanthine)、文多林(Vindoline)是半合成另一癌症治疗一线药物长春瑞滨的原料[3]。目前工业上长春碱主要是从长春花植株提取获得,存在着提取产率低、耗时等问题,且长春碱在植物中的含量极低,约为十万分之几。因此,寻找新的高效、节能、环保的提取和分离长春花中生物碱的生产工艺变得极为重要。近年来,纤维素酶被广泛应用于天然产物中有效成分的提取,它可以提高产品的产率和节约能源等。这是因为纤维素酶具有分解纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量及软化纤维素的作用,能使细胞的有效成分充分释放出来,达到提高提取产率的目的[4]。
   
  笔者应用纤维素酶对长春花进行酶解,采用RP-HPLC法测定长春碱、长春质碱和文多林的含量[3],通过单因素实验考察酶解的温度、pH、酶用量、酶解时间、浸提倍数对长春碱、长春质碱和文多林提取率的影响,优选最佳工艺条件,为酶解法应用于长春花工业生产提供一定的理论依据。

  1  仪器与材料

  1.1  仪器Waters 1525型高效液相色谱仪,2487型紫外检测器(美国,Waters);电子天平BT2202S(日本岛津);PB20型精密pH计(上海雷磁仪器厂)。

  1.2  试药纤维素酶(天津奥凯实业有限公司);长春碱、长春质碱、文多林(纯度≥98%,均自制);长春花采于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质圃;甲醇、乙腈为色谱纯,氨水、二乙胺、磷酸为分析纯,水为二次蒸馏水;所有试剂在使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。

  2  方法

  2.1  色谱条件色谱柱为Hypersil BDS-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)柱;流动相为380 ml水-二乙胺(986∶14,用磷酸调pH 7.2)与620 ml甲醇-乙腈(4∶1)混合;流速1.5 ml/min;柱温为25℃;检测波长260 nm;进样量10 μl。色谱图见图1。

  2.2  标准品溶液的制备精密称取适量长春碱、长春质碱、文多林对照品,用5 ml甲醇溶解并置于同一容量瓶中,摇匀,用甲醇定容。三者配置的浓度分别为0.5,0.5和1.0 mg/ml。保存于4℃冰箱备用。

  2.3  线性关系考察精密量取上述对照品溶液0.05,0.10,0.15,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00 ml,分别置于10 ml容量瓶中,摇匀,用甲醇定容。精密吸取各浓度溶液10 μl注入液相色谱,按“2.1”项下色谱条件测定相应的HPLC图谱的峰面积。以长春碱、长春质碱和文多林进样量X为横坐标,峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线,计算回归方程分别为Y长春碱=2.34×107X+1.28×105(r=0.999 7),Y长春质碱=2.45×107X+3.98×105(r=0.999 9),Y文多林=1.19×107X+8.52×104(r=0.999 9),结果表明,长春碱在0.001 7~0.006 8 mg/ml线性良好,长春质碱在0.008 2~0.032 9 mg/ml线性良好,文多林在0.018 6~0.093 1 mg/ml线性良好。该方法精密度、稳定性、重复性良好,加样回收率符合要求。

图片内容