低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β-catenin积聚的机制
作者：崔晓萍，林航，陈建梅，穆军山，叶建新，殷红兵，应大君
【摘要】 目的探讨低氧对星形胶质细胞内β-catenin积聚的机制。方法体外分离昆明小鼠海马星形胶质细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养12h和24h后，利用RT-PCR和Western blot法检测星形胶质细胞内Wnt通路相关蛋白Wnt3、Wnt3a及磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(PI3K/Akt)通路中磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)蛋白的表达情况。结果常氧培养的海马星形胶质细胞内存在Wnt3的表达，低氧对海马星形胶质细胞内Wnt3的表达无影响(P>0.05);常氧和低氧培养的海马星形胶质细胞内均不存在Wnt3a表达;低氧增加海马星形胶质细胞的p-Akt和p-GSK-3β蛋白水平(P<0.05)。结论低氧通过增加海马星形胶质细胞的p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白水平促进β-catenin积聚。
【关键词】 低氧;星形胶质细胞;Wnt;β-catenin;Akt;GSK-3β
ABSTRACT: ObjectiveTo explore the mechanism of hypoxia-promoted accumulation of β-catenin in astrocytes.MethodsAstrocytes were isolated, cultured and identified from Kunming mouse hippocampus in vitro, then cultured in hypoxia and traditional oxygen for 24 hours and 12 hours, respectively. The expressions of Wnt3 and Wnt3a in hippocampus astrocytes were detected by RT-PCR. The effect of hypoxia on the expressions of Wnt3 and Wnt3a in hippocampus astrocytes was analyzed by RT-PCR. The influence of hypoxia on the expressions of phosphorylated Akt and glycogen synthase kinase-3β(GKS-3β) protein was analyzed by Western blot.ResultsWnt3 was expressed in hippocampus astrocytes and hypoxia did not affect its expression (P>0.05). Wnt3a was not detected in hippocampus astrocytes in traditional culture or hypoxic culture condition. Hypoxia promoted the level of phosphorylated Akt and GKS-3β protein (P<0.05).ConclusionHypoxia increases the expression of β-catenin in astrocytes through promoting the level of phosphorylated Akt and GKS-3β protein in vitro.
KEY WORDS: hypoxia; astrocyte; Wnt; β-catenin; Akt;glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)
低氧预适应是指轻度低氧和短暂缺血的重复预处理触发和动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重低氧或缺血损伤产生强大的防御和保护作用[1]。在整体动物脑缺血预适应中，星形胶质细胞可能释放多种因子，作用于神经元[2-3]，但其具体的作用机制尚不清楚。研究表明，在低氧预处理后离体及在体动物均发生反应性星形胶质细胞增生，其作用可能与β-catenin的过度激活有关[4-5]。我们在前期工作中亦发现，β-catenin可促进(30±20)mL/L低氧条件下体外培养的神经前体细胞和胶质前体细胞增殖，并可在低氧培养的星形胶质细胞中积聚[6]，但其作用机制尚未明确。本实验选用海马星形胶质细胞，探讨低氧培养条件下，星形胶质细胞内β-catenin积聚的可能机制。
1材料与方法
1.1材料DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多抗购自Sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体、抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体(Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司，SuperSignal West Pico化学发光检测底物试剂盒购自Pierce公司，RT-PCR试剂盒、Trizol购自Invitrogen公司，SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉公司，新生昆明小鼠由南京军区福州总医院比较医学科提供，SPF级。
1.2方法
1.2.1昆明小鼠海马星形胶质细胞的分离、培养及鉴定选用2d龄小鼠，750mL/L乙醇浸泡消毒后迅速断头取脑，置于盛有D-Hanks液的玻璃培养皿中，用眼科剪剪去头部皮肤和颅骨，仔细去除脑膜和血管，剥离出大脑半球，用D-Hanks液清洗2次;在解剖显微镜下小心分离海马组织，置于另一盛有D-Hanks液的培养皿中。用眼科剪将海马组织剪碎成糊状，转移至带螺帽的离心管内，加入终浓度为1.25g/L胰酶，置于37℃水浴消化15～30min，每隔5min振荡1次，以含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目不锈钢筛网过滤，制备混合细胞悬液;收集于无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。加入含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基，将细胞密度调整为3～5×105个/mL，接种于50mL培养瓶内。置于37℃，饱和湿度，50mL/L CO2培养箱中培养，2～3d后换液。
1.2.2星形胶质细胞的纯化及鉴定培养7d后，贴壁细胞融合达90%以上，利用胰酶消化法传代，继续培养，连续传代3次后，所得细胞即是星形胶质细胞。鉴定时，将细胞接种于12孔板内的盖玻片上，3d后取出爬满细胞的盖玻片，进行GFAP免疫细胞化学鉴定(SP法)，步骤简述如下：PBS漂洗，以40g/L多聚甲醛液固定30min;PBS漂洗，5min×2次;30mL/L H2O2孵育5min;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;倾去，勿洗;滴加兔抗GFAP多克隆抗体(1∶100)，置于湿盒内4℃过夜;PBS洗，3min×3次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育60min;PBS洗，3min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS冲洗，3min×3次;DAB显色后脱水，透明封片并镜检。阴性对照将PBS替换一抗，其余步骤相同。
1.2.3星形胶质细胞的低氧培养将6孔板内的细胞置于50mL/L O2，50mL/L CO2/N2的低氧培养箱内培养12h和24h后，待细胞密度达80%以上融合后，取出细胞，进行相关指标检测。常氧培养的细胞为对照组，各组细胞各取3孔，分别进行3次实验。
1.2.4RT-PCR法检测星形胶质细胞中Wnt3和Wnt3a的表达用Trizol提取细胞总RNA;应用引物设计软件Primer Premier5.0设计引物，由赛百盛生物技术有限责任公司合成(表1)。cDNA合成和PCR扩增反应：2.0μg RNA，2.0μL Oligo(dT)15，2.0μL dNTP，0.25μL RNasein，0.5μL AMV反转录酶，4.0μL 25mmol/L MgCl2，4.0μL 5×buffer，加灭菌三蒸水至总体积20μL，42℃ 1h，选定扩增循环数为30。取逆转录cDNA 4.0μL，10×扩增缓冲液5.0μL，MgCl2 3.0μL，dNTP 3.0μL，上、下游引物10pmol，Taq DNA聚合酶1.0μL，加灭菌三蒸水至总体积50.0μL。在PCR仪上扩增，反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃(Wnt3)、53℃(Wnt3a)30s，72℃ 60s。扩增35循环。全部周期结束后于72℃延伸8min。内参基因为GAPDH。阴性对照组以去离子水取代cDNA模板，其余条件相同。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶图像分析系统进行分析。
1.2.5蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)检测各组星形胶质细胞中β-catenin、p-Akt和p-GSK-3β的表达分别提取各组星形胶质细胞总蛋白。取20μg样品蛋白100℃变性5min，行SDS-PAGE凝胶电泳。半干转膜(15V，60min)，50g/L脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入抗β-catenin单克隆抗体，抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体，抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体，稀释比例均为1∶200，4℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的抗兔/羊IgG(1∶1000)，室温孵育1h后，行化学发光检测，采用凝胶成像系统分析其相对吸光度(A)值，以β-actin作为校正。表1引物序列Tab.1Sequence of primers基 因引物产物长度
1.3统计学处理采用Bandscan软件对RT-PCR和WB所得条带进行吸光度扫描。实验数据以均数±标准差(±s)表示，结果采用SPSS统计软件对两样本均数进行t检验，P<0.05为有显著性差异。
2结果
2.1小鼠海马星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定海马组织细胞培养1h后开始贴壁。随着培养时间延长，细胞体积逐渐增大，伸出突起，呈聚集性生长，以梭形和多角形细胞为主。1周左右，原代细胞基本融合。连续传代培养3代后，细胞形态逐渐变得单一，为梭形或星形，胞质丰富，核大，境界清楚。染色质浅、均匀，有1～2个核仁，居于核中央(图1A)。GFAP的免疫细胞化学检测表明，GFAP表达主要位于胞质和突起内，胞核呈空泡状，不显色(图1B)。阳性细胞统计接近100%，表明培养的星形胶质细胞纯度已达实验要求。图1海马星形胶质细胞的鉴定Fig.1 Identification of hippocampus astrocytesA：相差倒置显微镜下(×400);B：GFAP的免疫细胞化学(SP, ×200)。
2.2低氧对β-catenin蛋白表达的影响经WB检测，与常规培养相比，星形胶质细胞经低氧培养12h和24h后，β-catenin蛋白表达均较常氧组增加(P<0.05，图2)。图2WB检测β-catenin表达Fig.2 Effect of hypoxia on the expression of β-catenin1：常氧培养;2：低氧培养12h;3：低氧培养24h。
2.3低氧培养对星形胶质细胞内Wnt3和Wnt3a表达的影响RT-PCR检测结果显示，常氧培养的星形胶质细胞内检测到Wnt3表达，但未检测到Wnt3a的表达;低氧培养24h后，星形胶质细胞内Wnt3的表达与常氧组相比，有下降的趋势;而Wnt3a表达仍未检测到(图3)。图3低氧培养前后Wnt3和Wnt3a表达的变化Fig.3 Effect of hypoxia on the expression of Wnt3 and Wnt3a1：Marker;2、4：常氧组Wnt3、Wnt3a;3、5：低氧组Wnt3、Wnt3a。