黄连生物碱降糖活性协同作用研究

                作者：朱家颖，岑晓凤，陈星，李学刚，陈竹，何凤玲，李平

【摘要】  　　目的比较黄连复合生物碱与单一生物碱的降糖作用。方法检测黄连复合生物碱及单一生物碱（小檗碱、药根碱、巴马汀碱、黄连碱）对人肝癌细胞HepG2的葡萄糖消耗量及对细胞存活率的影响；以四氧嘧啶获得高血糖小鼠模型，然后检测黄连生物碱对小鼠血糖值的影响。结果0.2～5 mg·L-1的生物碱即对细胞表现出降糖活性，小檗碱在5 mg·L-1时有显著细胞毒性。4种黄连生物碱单体中，小檗碱降糖活性较高，巴马汀降糖活性较差；复合生物碱具有比单一生物碱更好的降糖作用，且复合生物碱没有细胞毒性。结论黄连生物碱降糖活性存在协同作用，且安全性比单一生物碱更高。

【关键词】  黄连生物碱； HepG2细胞； 降糖活性； 协同作用

　　糖尿病防治是全球关注的重大健康问题，目前全球约有1.5亿患者［1］，预防和治疗糖尿病是一项非常迫切的任务。
   
　　黄连味苦、性寒，入心、肝、胃、大肠经，可清热燥湿，泻火解毒，作为中医治疗“消渴”病的常用药物而一直被临床广泛使用。黄连的有效成分为黄连生物碱，主要代表为小檗碱（BBR），约占总生物碱的50%；此外，尚含有巴马丁、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、木兰碱等，而小檗碱、巴马丁、黄连碱、药根碱等4个生物碱之和占总生物碱的90%［2］。大量的研究结果表明，BBR能够激活细胞中AMPK的活力、增加细胞对葡萄糖的消耗［3，4］、降低胰岛素抵抗等作用，显示出良好的治疗2型糖尿病作用［5］。
   
　　研究结果表明黄连总生物碱显示出比BBR更好的降糖活性：给小鼠灌喂BBR单体和含相同量BBR的黄连原粉后，发现黄连的降糖作用比BBR更强［6］。本研究利用HepG2细胞降糖实验方法和动物实验方法比较黄连总生物碱和小檗碱的降糖活性，为黄连活性成分类群的开发利用提供参考。

　　1  仪器与试剂

　　1.1  试验仪器Thermo 6500 二氧化碳培养箱，Eos Bravo W 全自动生化分析仪，金净 JJ-CJ-2F 洁净工作台，BioTek ELX800 酶标仪，ZEISS Axiovert 40 CFL倒置显微镜。

　　1.2  材料与试剂人肝癌胚胎瘤细胞HepG2购自中国典型培养物保藏中心。特级胎牛血清，批号 16000-044、RPMI 1640培养基，批号 31800-22，Gibco公司。葡萄糖酶法测定试剂盒，批号 364500，购自南京建成生物工程研究所。四甲基偶氮唑盐（MTT），胰蛋白酶，购自Sigma公司。人注射用胰岛素，批号 0909214，购自万邦生化医药公司。小檗碱、药根碱、巴马汀碱和黄连碱对照品，购自成都曼斯特公司，纯度98%。实验用黄连生物碱是从黄连中分离纯化制备而得，纯度98％以上。盐酸二甲双胍，购自南京泽朗植提，纯度98%。清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，合格证号No.0002400,第三军医大学动物室提供。

　　2  方法

　　2.1  细胞实验方法［7］

　　2.1.1  药物制备MTT、生物碱与阳性对照药二甲双胍均用PBS缓冲液配制，过滤除菌。使用时与含10% FBS的培养基按1：9比例混溶，药物终浓度为0.2，1，5 mg·L-1；MTT浓度5 g·L-1。
    　
　　复合生物碱的比例见表1。表1  黄连生物碱复合物的配比（略）

　　2.1.2  HepG2细胞的培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，CO2浓度5%并保持饱和湿度，对增殖状况良好的细胞用0.25%的胰酶消化并进行传代。

　　2.1.3   降糖试验及MTT试验将消化并稀释好的HepG2细胞加入到96孔板中，待细胞铺满率达80%，换掉原培养基，用PBS缓冲液清洗1次，将96孔板随机分为16组，每组每孔加入250 μl含药或不含药的培养液。24 h后利用葡萄糖酶法测定试剂盒于全自动生化分析仪中利用终点法，在505 nm波长下检测培养液中葡萄糖剩余量（试剂盒购自南京建成生物工程研究所），并加MTT，4 h后于酶标仪中490 nm波长下检测吸光度值。

　　2.1.4  药物对胰岛素处理后降糖活性试验将对数生长期细胞用胰酶消化并加入96孔板中，待细胞贴壁，移去培养液，加PBS清洗1次，换上含2.8×10-6 mol·L-1胰岛素及2% FBS的RPMI1640培养液，并设不含胰岛素的空白对照培养12 h。移去培养液，PBS清洗1次，换上含各种药物的无血清培养液。培养24 h后检测培养液中GLU消耗。

　　2.2  降血糖动物实验［8］清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，购自第三军医大学动物室（实验动物的合格证号为（No.0002400））。小鼠平衡饲养3 d后，饥饿12 h，然后尾部静脉注射四氧嘧啶（70 mg·kg-1）。3 d后，检测血糖。取血糖为10～25mmol/L的小鼠作为高血糖模型小鼠，按照血糖分为7组，每组10只。然后灌胃小檗碱（100 mg·kg-1）、黄连碱（100 mg·kg-1）、药根碱（100 mg·kg-1）、巴马汀（100 mg·kg-1）和黄连总生物碱（4号复合物，100 mg·kg-1），高糖对照组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃盐酸胍（100 mg·kg-1）。灌胃药物7 d，饥饿12 h，测定空腹血糖值。

　　2.3  统计方法用SPSS 13.0 做显著性检验。

　　3  结果

　　3.1  黄连生物碱及其复合物对HepG2降糖实验结果在没有胰岛素影响的情况下，黄连生物碱及其复合物对HepG2细胞消耗葡萄糖的测定结果表1。表1  黄连生物碱促进HepG2对葡萄糖的消耗量（略）