黄芪多糖对孕鼠鞘内注入布比卡因脊神经毒性的保护作用

                   作者：崔睿，徐世元，王建新，雷洪伊，蔡清香

【摘要】  　　目的探讨黄芪多糖是否可以减轻布比卡因对孕鼠脊神经毒性损伤反应及其保护机制。方法健康雌性妊娠17日SD大鼠，体质量350～400 g，取鞘内置管成功孕鼠30只，随机分成5组（n＝6）。对照组（N组），2％和4％布比卡因组（2B组和4B组），2％和4％布比卡因黄芪多糖治疗组（2H组和4H组）。N组：鞘内注射生理盐水30 μl，腹腔注入生理盐水；2B组或4B组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入生理盐水；2H组或4H组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入黄芪多糖（25 mg/kg，生理盐水稀释成2 ml，连续注药4 d）。鞘内注药后10 min，20 min，30 min，1 h，2 h，4 h，1 d，2d，3 d和4 d测定甩尾反应潜伏期（TFL），用最大效应百分比MPE表示，并进行下肢运动功能（MF）评分。4d后各组大鼠行断颈处死，分离背根神经节，Western blot分析Caspase-9蛋白表达水平和病理学观察。结果各组MPE比较差异有统计学意义（P<0.05）；鞘内注药后10 min， 2B组、4B组、2H组和4H组MPE均达到峰值，2B组和4B组于2 d恢复至基线水平，而2H组和4H组于1 d恢复至基线水平；在鞘内注药1 d，与4B组比较， 2H组和4H组MPE降低（P<0.05）。注入布比卡因后，各组MF评分较N组均明显升高（P<0.05）；2B组和2H组于注药后4 h恢复正常，而4B和4H组于1 d恢复正常。与N组比较， 2B组， 4B组， 2H组和4H组Caspase-9蛋白表达均上调（P<0.05）；与2B组比较， 2H组Caspase-9蛋白表达降低（P<0.05）。病理学结果：2B组和4B组有部分神经细胞萎缩、空泡化；2H组和4H组神经细胞萎缩、空泡化数量明显少于2B组和4B组。结论黄芪多糖对孕鼠布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定保护作用，其机制可能与抑制Caspase-9蛋白表达，抗神经细胞凋亡有关。

【关键词】  黄芪多糖； 布比卡因； 药物毒性； 妊娠； caspase-9； 凋亡

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effect of Astragalus polysaccharides(APS) on intrathecal ( IT ) bupivacaine neurotoxicity in pregnant rats and its mechanism.  MethodsThirty late pregnant rats weighting 350-400 g were used in this study. All the rats in which PE-10 catheter were successfully placed without complication were divided into 5 groups randomly (n=6 each): normal pregnant groups ( group N ), 2％ and 4％ bupivacaine groups ( group 2B, group 4B ) , 2％ and 4％ bupivacaine APS treated group ( group 2H, group 4H ) . Group N: received normal saline 30 μl IT and intraperitoneal injection with normal saline 2 ml. Group 2B or 4B: received 2％ or 4％ bupivacaine 30 μl IT and intraperitoneal injection with normal saline 2 ml. Group 2H or 4H: received 2％ or 4％ bupivacaine 30μl IT and intraperitoneal injection with APS (25 mg／kg , normal saline diluted to 2 ml, continuous injection 4 d). Tail-flick test and motor function were performed at 10min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 1 d, 2 d, 3 d and 4 d after IT administration. TF latent period was converted to the percent of maximal possible effect (MPE). Four days later, the animals were sacrificed and the DRG were removed for determination of caspase-9 protein expression by western blotting and the pathological changes were observed with light microscope. ResultsAfter the IT 10min, 2B, 4B, 2H and 4H group MPE reached the peak. MPE in group 2B and 4B returned to the baseline values after 2 d, in group 2H and 4H returned the baseline values after IT 1 d. In each group MF score was significantly increased after IT bupivacaine. Group 2B and 2H returned to normal after IT 4 h, then group 4B and 4H returned to normal after IT 1 d. Rats in group 2B, 4B, 2H and 4H significantly increase the expression of caspase-9 in DRG compared with those in group N. Compared with group 2B, rats in group 2H decreased significantly the expression of caspase-9 in DRG. Pathological results showed the neuroval injury in 2B and 4B group was more serious than in 2H and 4H group. Conclusion APS has neuron protection against neurotoxicity of intrathecal bupivacaine in pregnant rats, which is related with down-regulation of caspase-9 expression.

　　Key words：APS;  Bupivacaine;  Druy toxicity;  Pregnancy;  Caspase-9;  Apoptosis
   
　　近年来，国内外产科病人应用椎管内阻滞的比率逐年增加［1,2］，但有部分产妇应用局麻药进行椎管内阻滞后出现不同程度的神经系统并发症，出现此类并发症的原因可能与局麻药脊神经毒性损伤反应引起的神经细胞凋亡相关［3］。目前，已经发现黄芪多糖可以有效减轻脑再灌注损伤后神经细胞的凋亡［4］。黄芪多糖是否可以减轻局麻药脊神经毒性引起的神经细胞凋亡未见报道。本研究探讨黄芪多糖是否可以减轻布比卡因对孕鼠脊神经毒性损伤反应及其保护机制。

　　1  仪器与材料

　　1.1  试剂与仪器注射用黄芪多糖（批号：080201，美国泛华医药公司）。盐酸布比卡因分析品，纯度99.9%（批号：014252803，Sigma公司，美国）。兔抗大鼠Caspase-9多克隆抗体（批号：F00037626，Santa Cruz公司，美国）。GAPDH-HRP（批号：KC-5G5，上海康成生物科技有限公司）。PE-10导管（宁波市科技园区安来软件科技有限公司）。鼠尾光照测痛仪（型号：YLS-12A，山东省科学设备站）。

　　1.2  动物

　　健康雌性SD大鼠，体质量180～220 g，由广东省实验动物中心提供。在室温18～28℃，相对湿度40% ～70%的屏障系统内饲养，不控制饮食，发情期将雌性大鼠和雄性大鼠(比例为5∶1)同笼饲养，每日行阴道涂片，镜下见到精子作为妊娠的第1日。选用妊娠17日孕鼠（体质量350～400 g）为研究对象。

　　2  方法

　　2.1  鞘内置管 10％水合氯醛（250mg/kg）腹腔注射麻醉，探及脊柱下段的一个钝形突起——髋结节, 其水平位置即为大鼠的L6［5］，于L5～L6椎间隙向头侧置入PE-10导管2 cm。固定导管，埋于皮下。植入过程中见清亮脑脊液从导管内缓慢流出，可证实在蛛网膜下腔。术毕肌注青霉素钠，台灯照射保温1～2 h。大鼠单笼饲养2 d，出现肢体运动障碍的大鼠排除本研究。

　　2.2  实验分组和给药取鞘内置管成功孕鼠30只，随机分成5组（n＝6）。对照组（N组），2％和4％布比卡因组（2B组和4B组），2％和4％布比卡因黄芪多糖治疗组（2H组和4H组）。N组：鞘内注射生理盐水30 μl，腹腔注入生理盐水。2B组或4B组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入生理盐水。2H组或4H组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入黄芪多糖（25 mg/kg，生理盐水稀释成2 ml，连续注药4 d）。各组鞘内注药完毕后，用10 μl生理盐水冲洗导管。

　　2.3  MPE的计算测定大鼠热辐射甩尾反应潜伏期(TFL)，将高强度光束照射到鼠尾中下三分之一不同部位，从开始照射到大鼠产生甩尾反应的时间为TFL。如果光照时间到达10 s时，大鼠仍不甩尾，则停止照射，这时TFL记作10 s，连续测定3次，每次间隔15 s，取其平均值。鞘内注药后10，20，30 min，1，2，4，1，2，3 d和4 d测定TFL。TFL用最大效应百分比MPE表示，MPE（%）=(注药后TFL-TFL基础值)／(10-TFL基础值)×100％ 。