苦豆子总碱及4种单体生物碱对幽门螺杆菌的体外抑菌作用研究

【摘要】  　　目的 探讨苦豆子总碱、苦参碱、苦参素、槐定碱、槐果碱体外抑制幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）的作用。方法选用5种苦豆子生物碱，纸片扩散法粗测抑菌浓度范围；依据粗测范围，液体倍比稀释法测定5种生物碱的最小抑菌浓度(MIC)。结果苦豆子总碱的MIC为32 mg/ml，在体外对Hp有一定的抑制作用。苦参碱、苦参素的MIC为64 mg/ml，槐定碱的MIC为128 mg/ml，体外抑菌活性微弱。槐果碱在体外对Hp无明显抑制作用。结论苦豆子总碱有可能成为替代抗生素的抗Hp候选药物。

【关键词】  幽门螺杆菌； 苦豆子总碱； 苦参碱； 苦参素； 槐定碱； 槐果碱

　　幽门螺杆菌（Helicobacter  pylori，Hp）感染是慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤、胃腺癌的主要病因［1］。根除Hp已成为现代治疗Hp相关性胃肠疾病的重要措施。近年来，由于甲硝唑、阿莫西林等抗菌药物的广泛应用，使得Hp的耐药日益严重［2］。因此，寻找新型抗Hp药物取代或辅助抗生素进行Hp根除治疗，减少耐药菌株发生，有重要的临床意义。苦豆子 Sophora alopecuroides. L.属豆科槐属植物，具有清热解毒、抗菌消炎作用，民间用其治疗胃痛、腹泻等症。苦豆子类生物碱是从苦豆子的干燥全草和种子中提取的生物碱。有研究报道，苦豆子类生物碱对大肠杆菌、痢疾杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌等具有良好的抗菌作用［3］。本研究从文献报道中遴选了5种抗菌作用明显的生物碱，进行了抗Hp作用的体外实验研究，以期发现有效的非抗生素类抗Hp药物。
　　
　　1   材料
　
　　1.1  材料苦豆子总碱(Total alkaloids of sophora alopecuroides，TASA，批号：20081125)、苦参碱(matrine，批号：20080904)、苦参素(oxymatrine，批号：20080301)、槐定碱(sophoridine，批号：20081226)、槐果碱(sophocarpine，批号：20090115)均购自宁夏紫荆花药业公司。

　　1.2  试剂BBLTM Columbia Agar Base（Becton,Dickinson and Company，REF 211124，批号：7184335)；布氏肉汤(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20081029)；无支原体新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：080816)；万古霉素(上海生工，批号：V0990)；两性霉素B(上海生工，批号：A0414)；多粘菌素(Sigma公司，批号：81334)；TMP(BIO BASIC INC，批号：T714208)。

　　1.3  菌株 Hp标准菌株NCTC11637购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所；用于分离Hp的胃黏膜样本采自兰州大学第一医院胃镜室。

　　1.4  培养基哥伦比亚固体培养基：Columbia Agar Base 4.25 g，三蒸水100 ml，万古霉素250 mg/L，两性霉素B 200 mg/ L，多粘菌素220 mg/L，TMP 300 mg/ L，脱纤维羊血5 ml，10%葡萄糖5 ml；液体培养基：布氏肉汤粉2.8 g，新生牛血清2 ml，10%的葡萄糖1 ml，淀粉0.1g。

　　1.5  仪器

　　幽门螺杆菌厌氧培养罐(HP015，广州海太光电生物科技有限公司)；SW-CJ-2F型洁净工作台（苏州净化设备有限公司）；BMC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；光学显微镜（OLYMPUS）；分析天平（上海光学仪器厂）。

　　2  方法

　　2.1  Hp的分离培养于慢性浅表性胃炎、胃溃疡患者胃窦部用灭菌活检钳钳取活组织1块（标本采集前作快速尿素酶试验，“++”以上者取材），划线接种于哥伦比亚培养基，微需氧条件（85%N2，10%CO2和5%O2），温度37℃，湿度95%培养3～5 d。菌落通过形态学鉴定和生化鉴定进行判断。刮取培养的阳性菌落并复苏冻存的Hp标准菌株，固体增菌培养48 h，转种于液体培养基，置于振荡培养箱中，于85%N2，10%CO2和5%O2，温度37℃条件下，转速120 r/min，振荡培养24 h，调整细菌浓度为1×107～108 CFU/ml，备用。

　　2.2  苦豆子生物碱的抑菌活性检测

　　2.2.1  纸片琼脂扩散法测定药物抑菌浓度以三蒸水为溶剂，1%HCl调整pH值为7.6，倍比稀释配制药物溶液，浓度分别为200，100，50，25，13 mg/ml。取无菌新华滤纸，用打孔器制为直径6 mm的纸片，于上述药物溶液中浸泡过夜，干燥、备用。取50 μl浓度约1×108 CFU/ml的Hp对数期菌液于哥伦比亚培养基，L棒涂布均匀。自然干燥后，放入药敏纸片，微需氧条件（85%N2，10%CO2和5%O2），温度37℃，湿度95%，继续培养48 h后取出，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，取其平均值。同一种药物重复3次。

　　2.2.2  试管倍比稀释法测定药物最小抑菌浓度（MIC）待测药物用布氏肉汤稀释，其终浓度为512 mg/ml，并用1%HCl调整pH值为7.6。取无菌试管10支，每支试管中加入液体培养基1 ml，以2倍倍比稀释法调整药物浓度依次为256，128，64，32，16，8，4，2 mg/ml。第9管不加药液加菌液，作为阴性对照。第10管不加菌液不加药液，作为阳性对照。各管分别加入100 μl浓度约1×107 CFU/ml的Hp对数期菌液，于85%N2，10%CO2和5%O2，温度37℃条件下，转速120 r/min，振荡培养24 h。肉眼观察浑浊度并取样涂片于镜下观察。同时取100 μl至哥伦比亚培养基划线接种，继续培养48 h后取出，观察菌落情况并涂片于镜下观察。以无细菌生长平皿的最小药物浓度作为该药物的MIC。同一种药物重复3次，取均值。