高速逆流色谱法制备岩黄连中的脂溶性生物碱
【摘要】 目的采用高速逆流色谱法对岩黄连中的脂溶性生物碱进行制备分离。方法经过筛选确定溶剂系统为正己烷醋酸乙酯甲醇水(3∶7∶5∶5;1.5∶5∶1.5∶5)、正己烷醋酸乙酯甲醇0.2 mol/L盐酸(1∶3.5∶2.5∶4.5)，上相作固定相，下相作流动相，转速860 r/min，流速1.2 ml/min。结果经连续3次高速逆流色谱分离，可直接从岩黄连的醋酸乙酯粗提物(300 mg)中得到4个纯度较高的脂溶性生物碱，经过与对照品比较保留时间及质谱鉴别，确定产物为Cheilanthifoline(12.3 mg，纯度：76.1%)、Thalictrifoline(3.6 mg，纯度：83.1%)、Tetrahydropalmatine(13.7 mg，纯度：85.5%)、Canadine(8.7 mg，纯度：78.5%)。结论采用高速逆流色谱法制备分离岩黄连中的脂溶性生物碱，快速、简便、产物得率和纯度较高。
【关键词】 高速逆流色谱; 岩黄连; 生物碱
岩黄连系罂粟科紫堇属多年生草本植物石生黄堇Corydalis saxicola Bunting的全草。作为黔桂高寒山区的特效草药，长期以来岩黄连一直被广泛应用于治疗热毒痈疮、急性腹痛、急性黄疸型肝炎等症。经过系统分离方法，我们已经确定岩黄连的主要成分为生物碱[1]。鉴于其中的化合物结构相似，制备纯化过程耗时长、溶剂消耗大，化合物得率低，本研究采用高速逆流色谱法探索岩黄连中生物碱的快速制备方法。
高速逆流色谱法(high-speed countercourrent chromatography, HSCCC)是在20世纪80年代由美国Yoichiro Ito教授首先研究和发展起来的一种现代色谱分离制备技术[2]。HSCCC不使用固相载体作固定相，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点[3]，可在短时间内实现高效分离和制备。 据报道，HSCCC制备分离生物碱的经典溶剂系统为氯仿甲醇体系;考虑到该溶剂对仪器的损耗，本研究根据溶剂平衡时间、化合物分配系数等参数对多组溶剂系统进行筛选，建立了快速制备分离岩黄连中脂溶性生物碱的HSCCC方法。
1 材料与仪器
1.1 试剂及药品色谱纯试剂：乙腈(Tedia Company，Fairfield，USA)分析纯试剂：正己烷，醋酸乙酯，甲醇，盐酸(天津市红岩化学试剂厂)。对照品：Cheilanthifoline，Thalictrifoline，Tetrahydropalmatine，Canadine为实验室自制(HPLC检测纯度>95%)。
1.2 仪器QuilPrepTM Chassis MK V 500/Series II HPLC Pump高速逆流色谱仪(英国/AECS美国SSI)，配有四组不锈钢线圈(110 ml×42 mm)和5 ml定量环;Waters Fraction Collector III自动流分收集器;Waters 600E型高效液相色谱仪, Waters 996二极管阵列检测器。Thermo LCQ DECA XP 高效液相色谱-质谱联用仪(ESI-MS);JY 98-Ш超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)。
2 方法
2.1 供试品的制备 取适量岩黄连药材粉碎过60目筛，用6倍量95%乙醇超声提取3次，过滤，合并滤液浓缩后混悬于水中，用醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，干燥后得提取物备用。
2.2 HSCCC溶剂系统选择每次称取醋酸乙酯萃取物约4 mg置于试管中，分别取上相、下相溶液各2 ml溶解样品，充分振荡溶解。待两相平衡后，分别取上相、下相溶液，挥干，再用甲醇溶解，进行HPLC分析。计算不同溶剂系统中，目标化合物的分配系数K值和两相溶剂系统的“平衡时间”：即当上相与下相溶剂混合时，两相系统达到完全分层的时间，该参数与固定相的保留率密切相关。K=目标化合物在上相溶液中的峰面积值A1目标化合物在下相深液中的峰面积值A2表1 不同溶剂系统的平衡时间及主要化合物在溶剂中的K值溶剂系统组成比例
2.3 HSCCC制备分离将溶剂系统置分液漏斗中，混匀，静置过夜，分成固定相(上层)和流动相(下层)。使用前超声30 min。称取醋酸乙酯萃取物300 mg，用5 ml的下相溶液溶解，作为HSCCC的样品，备用。首先将固定相(上相)泵入高速逆流色谱仪，待线圈内充满固定相后，调转速至860 r/min。然后将流动相泵入色谱仪，待流动相从管柱出口流出，基线稳定，即达到平衡时，将5 ml样品(300 mg/5 ml)溶液注入高速逆流色谱仪。流速为1.2 ml/min，转速为860 r/min。紫外检测器，检测波长为270 nm。流份由自动接收器收集。进样110 min后，停止主机转动，用氮气将固定相推出，测得保留率均大于80%。