葡萄内酯和马尔敏的合成及活性研究
作者：张普照 黎艳刚 涂明珠 张亚梅 陈海芳 杨武亮
【摘要】 目的研究葡萄内酯和马尔敏的合成方法及生物活性。方法以香叶醇和伞形酮为起始原料，通过氯代、成醚反应合成葡萄内酯，再经Sharpless不对称烯烃羟基化反应合成马尔敏，采用1H-NMR对化合物进行结构鉴定;通过体外药理实验测定葡萄内酯对小鼠胃肠蠕动和大鼠脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶的影响。结果葡萄内酯和马尔敏的合成产率分别为50.67%，20.5%;葡萄内酯促进胃肠动力作用强度为44%，低、中、高3个剂量组均能明显抑制大鼠大脑组织匀浆乙酰胆碱酯酶的活性。结论该合成路线简单、产率高，能实现工业化生产;葡萄内酯在促进胃肠动力和治疗老年痴呆新药研究具有潜在价值。
【关键词】 葡萄内酯; 马尔敏; 合成; 胃肠动力; 乙酰胆碱酯酶
Abstract：Objective To study the synthesis and activity of auraptene and marmin.
MethodsAuraptene was prepared by chlorinenation and etherification with geraniol and umbelliferone as starting material.Marmin was synthesized by sharpless aymmetric dhydroxylation with auraptene as material. The structures of products were identified by 1H-NMR spectra. The gastrointestinal propulsive motivity and acetylcholinesterase inhibition of auraptene were determined in vitro.
ResultsTheir yield reached 50.67%, 20.5%,respectively.The bioactivity results indicated that auraptene showed similar gastrointestinal propulsive motivity with domperidone and the propulsive rate was higher than 44%.The low, middle and high doses of auraptene had the inhibitory effects on acetylcholinesterase in rat brain(P<0.5).
ConclusionThis synthetic route has advantages of convenience,simple operation and high yield and is suitable for industrial manufacture.It has the potentiality in the study on medicine of the gastrointestinal propulsive motivity and Alzheimer's disease.
Key words：Auraptene; Marmin; Gastrointestinal Motility; Synthesis; Acetylcholinesterase
葡萄内酯和马尔敏是从葡萄皮和柑桔属植物中分离得到的，其生物活性近年来引起了研究人员的关注，文献报道马尔敏和葡萄内酯具有显著的抗肿瘤、神经保护、抗炎和自由基清除等活性[1～6]。我们通过动物模型实验研究发现葡萄内酯具有促进胃肠动力作用，两者很可能成为新药候选化合物，然而在植物中的含量均较低，影响对其的开发利用。我们对提取工艺进行优化后，虽能从枳壳等柑桔属植物中提取分离到千克级的葡萄内酯，然而提取费用较高;与葡萄内酯相比，马尔敏的植物来源更少，在植物中的含量更低。所以，开发葡萄内酯和马尔敏的化学合成方法既满足现实的迫切需要，又有着潜在的经济利益和学术价值。
据文献与专利检索得知，目前尚无有关葡萄内酯化学合成方法的报道，马尔敏的化学合成方法虽多有报道，但合成路线较复杂，收率较低，无法实现工业化生产[7，8]。本文结合手性合成的新研究成果，提出了全新的合成路线，合成路线如图1所示，以香叶醇和伞形酮为初始原料，通过氯代、成醚反应合成出葡萄内酯(3)，再经Sharpless不对称烯烃羟基化反应，合成马尔敏(4)，步骤少，目标化合物收率较高，适合工业化生产。图1 葡萄内酯和马尔敏合成路线
1 仪器与材料
Bruker-Avance-400核磁共振仪(TMS为内标)，722可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司制造)，DY89-1型电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司);氢溴酸加兰他敏注射液(上海旭东海普药业有限公司)，乙酰胆碱酯酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，蛋白定量测定盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，香叶醇(sigma试剂)，三溴化磷(国药集团化学试剂有限公司)，7-羟基香豆素(AR，上海晶纯试剂有限公司)，AD-mix-β(sigma试剂)，其余试剂均为分析纯。
动物：清洁级KM小鼠80只(雌雄各半，体质量20～22 g，江西省实验大小鼠生产基地提供);吗丁啉(西安杨森制药有限公司)。
2 方法
2.1 葡萄内酯和马尔敏的合成
2.1.1 香叶基溴的合成[9]
取香叶醇5.0 g(0.032 mol)溶于100 ml无水石油醚中，加热溶解后，冰盐浴下加入吡啶2.6 ml，搅拌下缓慢滴加含有PBr3 3.5 g(0.013 mol)的石油醚溶液26 ml，冰盐浴下反应3 h后，向其中加入10 ml水和80 ml甲醇的混合液，继续搅拌5 min，分出有机层(上层)，用饱和NaHCO3溶液洗至pH=7，然后水洗，无水Na2SO4干燥，减压浓缩得无色油状液体5.5 g，粗产率为78%。
2.1.2 葡萄内酯的合成[10]将上步反应产物5 ml加入到含3.0 g7-羟基香豆素,33.4 gK2CO3,38.25 gKI的200 ml丙酮溶液中，加热回流7 h后停止反应(TLC监测)，冷却，过滤，滤饼丙酮洗涤，合并母液，浓缩得黄色物质。将所得黄色物质甲醇溶解，拌样，过硅胶柱，用石油醚、醋酸乙酯梯度洗脱[15∶1(160 ml)、10∶1(330 ml)]，合并具有相同斑点的流份，减压浓缩得浅黄绿色针状结晶，甲醇重结晶后得针状无色结晶，即葡萄内酯2.78 g，产率为50.67%。
2.1.3 马尔敏的合成[11]室温下将3.477 3 g AD-mix-β加入到25 ml正丁醇和25 ml水的混合溶液中，待完全溶解后冷却至0℃，加入葡萄内酯0.573 3 g,TLC监测，反应50 h后,加入3.8 g Na2S2O3,于室温反应1 h，反应液用乙酸乙酯萃取3次，浓缩，甲醇溶解，拌样，过胶柱，用石油醚∶醋酸乙酯(3∶1，2∶1，1∶1)梯度洗脱，合并具有相同斑点的流份，浓缩得黄绿色物质，甲醇重结晶后得无色片状结晶，即马尔敏0.13 g，产率为20.5%。
2.2 葡萄内酯的活性测试
2.2.1 葡萄内酯对小鼠胃肠蠕动的影响小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。对照组为蒸馏水组，吗丁
啉组(6 mg/kg)，葡萄内酯低剂量组(0.6 mg/kg)，中剂量组(1.2 mg/kg)，高剂量组(2.4 mg/kg)。各组小鼠禁食不禁水12 h，次日灌胃给药一次(0.4 ml/20 g)，过60 min后灌服阿拉伯胶活性炭粉混合物(0.3 mL/只)，20 min后处死小鼠，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长，以两者之比计算推进百分率。用于观察小鼠胃肠推进功能的指示剂为阿拉伯胶活性炭粉混合物 (2.5 g纤维钠加水62.5 ml，加入奶粉4 g、糖2 g、淀粉2 g、活性炭0.75 g，搅拌混匀，配成75 ml的糊状物)。小肠推进率(%)=(碳糊移动距离/幽盲全长)×100%
2.2.2 葡萄内酯对大鼠脑组织匀浆ACHE的影响取雄性大鼠3只，断头取脑，用干净的滤纸吸干大脑组织表面的水分和血液。置于玻璃匀浆器中，按脑组织与生理盐水1∶9的比例加入生理盐水，匀浆器匀浆5 min，制成10%匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清待测;每只大鼠的脑组织匀浆分为5组，加入等量不同浓度的葡萄内酯溶液及加兰他敏水溶液，空白组加入等量的双蒸水。葡萄内酯溶液浓度为(1，2，4 mg/L)，阳性药物加兰他敏水溶液(2 mg/L)，充分混匀后待测。采用双缩脲法测定蛋白总含量，用改良Ellman比色法测定ACHE的活力，平行实验3次。严格按照试剂盒上的说明进行操作，计算公式如下：
蛋白标含量=测定管OD值-空白管OD值标准管OD值-空白管OD值×标准蛋白浓度
组织匀浆ACHE活力=测定管OD值-对照管OD值标准管OD值-空白管OD值×标准管浓度/蛋白含量
2.3 统计学处理所测数据均以±s表示, 采用SPSS11.5统计软件进行两样本的t检验,P<0.05或P<0.01认为有显著性差异。