灯盏乙素对脂多糖加卡介苗所致小鼠免疫性肝损伤保护作用的机制研究

【摘要】  目的在前期工作基础上，对灯盏乙素对脂多糖加卡介苗所致小鼠免疫性肝损伤保护作用的机制进行研究。　　方法建立脂多糖加卡介苗(LPS+BCG)致小鼠免疫性肝损伤模型，灯盏乙素50，100，200 mg·kg-1，1次/d，连续灌胃给药12 d。测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、总一氧化氮合酶(total Nitricoxide synthase, total NOS)、结构型一氧化氮合酶(Constitutive Nitricoxide synthase, cNOS)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitricoxide synthase, iNOS)等生化指标。结果灯盏乙素低、中、高3个剂量组均能显著降低LPS+BCG致肝损伤小鼠血清中ALT水平，各剂量组能不同程度提高肝组织匀浆中CAT，SOD，GSH-Px的活性以及降低XOD，MDA，NO的含量。对一氧化氮合酶各分型分析表明，灯盏乙素能显著降低总NOS和iNOS的表达，对cNOS的表达基本没有影响。结论灯盏乙素对脂多糖加卡介苗引起的免疫性肝损伤具有保护作用的机制可能与其抗脂质过氧化，增强机体对自由基的清除能力及调节体内NO水平等有关。

【关键词】  灯盏乙素; 脂多糖; 卡介苗; 免疫性; 肝损伤; 抗氧化; 一氧化氮

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the mechanism of the protection of scutellarin against immunological liver injury induced by BCG+LPS in mice according to our previous study.

　　MethodsExperimental immunological liver injury model was created by Calmette-Guerin bacillus vaccine (BCG) and lipopolysaccharide (LPS) in mice. Mice were treated with scutellarin 50, 100, 200 mg·kg-1 through oral gavage once daily for 12 consecutive days. The level of ALT in serum, the contents or activities of SOD, MDA, GSH-Px, CAT, XOD, NO, total NOS, iNOS, cNOS in liver tissues were monitored.

　　Results Three doses of scutellarin (50, 100, 200 mg·kg-1) could significantly decrease the level of ALT, significantly increase the activities of CAT, SOD, GSH-Px, and decrease the contents of SOD, MDA, NO in liver tissue. According to NOS analysis, scutellarin could decrease the expression of total NOS and iNOS, but it had no effect on the expression of cNOS.

　　ConclusionThe mechanism of the protection of scutellarin on immunological liver injury induced by BCG+LPS in mice might attribute to preventing lipid peroxidation, reinforcing capability of free radical clearance, adjusting the level of NO in the body.

　　Key words：Scutellarin; Calmette-Guerin bacillus vaccine; Lipopolysaccharide ; Immune; Liver injury; Antioxidation; Nitric oxide

　　灯盏乙素(scutellarin)又名野黄芩苷，是菊科植物短葶飞蓬的干燥全草(灯盏细辛)中提取的黄酮类有效成分[1]。灯盏乙素具有增加血流量、改善微循环、扩张血管、降低血粘度、降血脂、促纤溶、抗血栓、抗血小板凝聚等作用，被临床上广泛用于脑血栓、冠心病心绞痛等缺血性心脑血管疾病的治疗[1]。另有大量的研究表明黄酮类化合物对多种实验性肝损伤模型均有保护作用[2]， 因此我们对灯盏乙素对各种实验型肝损伤模型的作用进行了深入研究后发现灯盏乙素可改善脑缺血再灌注后所致的肝功能损伤[3], 对利福平和异烟肼合用致小鼠肝损伤也具有明显的保护作用[4], 且能显著抑制卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)所诱导的免疫性肝损伤[5]，在原来的研究基础上，本课题拟对灯盏乙素对脂多糖加卡介苗所致小鼠免疫性肝损伤保护作用的机制进行深入研究。现报道如下。

　　1 材料

　　1.1 动物健康雌雄各半昆明种小鼠，体质量18～22 g，SPF级，购自广西壮族自治区食品药品检验所实验动物中心，合格证号：SCXK桂2003-0001。

　　1.2 药品与试剂灯盏乙素(98.81%)购自云南玉溪万方天然药物有限公司，批号051202;脂多糖(LPS)，购自美国Sigma公司，批号：L-2880;皮内注射用卡介苗(BCG)(5人份/支)，成都生物制品研究所生产，批号：20070303，由广西区疾病控制中心提供;联苯双酯滴丸(Bifendate Pills)购自广州星群(药业)股份有限公司，批号：DF40099;谷丙转氨酶(ALT)、过氧化氢酶(CAT)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、各一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒均购自南京建成生物制品研究所。

　　2 方法

　　2.1 造模和给药方法[5]将小鼠按体质量随机分为6组：正常对照组，模型对照组，联苯双酯组，灯盏乙素低剂量组、中剂量组、高剂量组。除正常组每只小鼠尾静脉注射生理盐水0.2 ml外，其余各组每只小鼠均尾静脉注射BCG 0.025 mg，注射BCG后，正常组和模型组小鼠均ig蒸馏水，联苯双酯组小鼠ig联苯双酯200 mg·kg-1，灯盏乙素低、中、高3个剂量组分别ig灯盏乙素50，100，200 mg·kg-1，1次/d，各组均连续给药12 d。第12天， 除正常组每只小鼠尾静脉注射生理盐水外，其余各组每只小鼠均尾静脉注射LPS 4 μg攻击，以诱导肝损伤。

　　2.2 标本采集全部小鼠LPS攻击12 h后，摘眼球取血，脱颈椎处死后，迅速摘取肝脏-80℃冻存备用。

　　2.3 肝组织匀浆制备取冰冻小鼠肝组织，用冰盐水漂洗，吸水纸吸干，称取0.5 g放入10 ml EP管中，将EP管置于冰水中，尽快剪碎组织，并加入为肝组织块重量9倍的生理盐水(W∶V=1∶9)，再将EP管插入盛有冰水混合物的烧杯中，用超声波粉碎机，在400 A，5 s/次，间隙10 s反复3～5次条件下，进行粉碎使组织匀浆化，继以3 000 r·min-1低温离心15 min，轻轻吸取适量上清液进行各种测定。

　　2.4 指标测定方法 血清ALT、肝组织匀浆CAT，XOD，SOD，MDA，GSH-Px，NO，iNOS，和cNOS的测定按试剂盒说明进行操作。

　　2.5 统计学方法数据采用±s，组间比较进行t检验，采用Microsoft Excel统计软件进行分析处理。

　　3 结果

　　3.1 灯盏乙素对LPS+BCG致肝损伤小鼠血清ALT和肝组织MDA的影响 模型组小鼠血清ALT明显升高，与正常组比较，P<0.001;联苯双酯组和灯盏乙素低、中、高3个剂量组均可显著降低小鼠血清ALT，与模型组比较，P<0.05。模型组小鼠肝组织匀浆中MDA含量显著升高，与正常组比较，P<0.05;联苯双酯和灯盏乙素低、中、高3个剂量均能显著降低MDA的含量(P<0.05)。结果见表1。表1 灯盏乙素对LPS+BCG致肝损伤小鼠血清ALT和肝组织MDA的影响

　　组小鼠肝组织匀浆中CAT活性降低，联苯双酯组和灯盏乙素低、中、高各个剂量组CAT的活性升高，其中灯盏乙素高剂量组CAT活性与模型组比较升高显著，P<0.05;模型组小鼠肝组织匀浆中XOD活性显著升高，与正常对照组比较，P<0.001;联苯双酯组XOD活性与模型组比较无显著性差异，但灯盏乙素低、中、高3个剂量组均能显著降低XOD的活性(P<0.01或P<0.001);模型组小鼠肝组织匀浆中SOD活性显著降低，与正常组比较，P<0.05;灯盏乙素低、中、高3个剂量组均能显著升高SOD的活性(P<0.05或P<0.001)，且随着剂量的增加升高明显;模型组小鼠肝组织匀浆中GSH-Px活力显著降低，与正常组比较P<0.05;灯盏乙素低、中、高3个剂量组均能显著升高GSH-Px活力(P<0.05或P<0.001)。结果见表2。表2 灯盏乙素对LPS+BCG致肝损伤小鼠肝组织匀浆中CAT、XOD、SOD和GSH-Px的影响

　　3.3 灯盏乙素对LPS+BCG致肝损伤小鼠肝组织匀浆中NO和NOS的影响模型组小鼠肝组织匀浆中NO含量显著升高，与正常组比较，P<0.001;联苯双酯组和灯盏乙素低、中剂量组能明显降低NO的含量(P<0.05)。模型组小鼠肝组织匀浆中总NOS、iNOS活力均显著升高，与正常组比较，P<0.01;联苯双酯组和灯盏乙素低、中、高3个剂量组肝组织匀浆中总NOS活力与模型组比较显著降低(P<0.01或P<0.001)。同时，联苯双酯组和灯盏乙素各个剂量组肝组织匀浆中iNOS活力也显著降低(P<0.05或P<0.01)。但各组肝组织匀浆中cNOS比较无显著差别(P>0.05)。结果见表3。表3 灯盏乙素对LPS+BCG致肝损伤小鼠肝组织匀浆中NOS的影响

　　4 讨论

　　BCG为牛型结核杆菌的减毒菌株，具有很强的非特异性免疫刺激作用，可使多核中性粒细胞或巨噬细胞聚集于肝组织中，激活外周淋巴细胞，使其在肝组织内浸润;LPS为革兰氏阴性菌的细胞壁最外层结构，是类脂质、多糖和蛋白质的复合体，即内毒素，在体内可引起多种生物学效应，在BCG存在的条件下，当注射微量LPS后进一步激活处于致敏状态的巨噬细胞，使其释放大量细胞毒性因子如NO、自由基、白三烯等造成肝细胞损害，诱导免疫性肝损伤，导致以弥漫性肝细胞炎症和坏死为主要的病理学特征病变[6]，因其病理特征与临床上肝炎发生的病理过程十分相似，因此作为筛选和研究保肝药物较为理想的模型之一。

　　血清ALT目前被认为是反映肝损伤的敏感指标，肝损伤使细胞通透性增加，胞内ALT释放入血。SOD、CAT和GSH-Px属于防御系统酶类，在维持机体活性氧代谢的平衡中起重要作用[3，6]。SOD主要功能是催化超氧阴离子的歧化反应，其活性越高，则清除超氧自由基能力越强。CAT是清除H2O2的重要酶类，其主要功能是将SOD催化生成的H2O2，进一步催化生成H2O，从而起到彻底清除自由基的作用。GSH-Px是一重要的催化过氧化物分解的酶类， 它可以催化过氧化氢和脂质过氧化物的还原。而MDA是自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物，可反映机体脂质过氧化程度，是评价自由基损伤的关键指标， 其含量高低与自由基损伤程度密切相关。黄嘌呤氧化酶(XOD)是体内核酸代谢中的重要酶之一 [3，6]，可催化黄嘌呤产生氧化反应，释放大量的自由基，从而造成生物膜的损伤，导致细胞内环境紊乱，能量代谢障碍，蛋白合成受抑制，各种水解酶及毒性活性物质释放等。NO是一种活性介质，NO在体内由L-精氨酸经NOS催化合成。肝脏组织中有两种类型NOS，即cNOS和iNOS，cNOS分布于血管内皮细胞和血小板等处，合成的NO大部分释放入血液，其生物效应以生理状态下细胞间信息传递为主，具有扩张血管，提高肝脏血液灌流而达到保护肝脏的作用;iNOS分布于肝细胞、枯氏细胞等处，可被LPS多种细胞因子诱导活化，产生大量具有细胞毒性作用的NO，参与各种肝病的病理过程[3，6]。

　　通过对BCG+LPS联合诱导小鼠肝损伤实验表明灯盏乙素低、中、高3个剂量组均能显著降低血清中ALT水平。灯盏乙素高剂量组能显著提高小鼠肝组织匀浆中CAT活性， 3个剂量组均能显著升高SOD、GSH-Px水平，显著降低XOD、MDA和NO的含量。对一氧化氮合酶各分型分析表明，NO含量的降低主要是与灯盏乙素可降低iNOS的表达有关。以上提示灯盏乙素对LPS+BCG所致免疫性肝损伤的保护作用可能与其抗脂质过氧化、减少过氧化脂质的生成、增强机体对自由基的清除能力、通过影响iNOS的表达而降低肝损伤组织中NO水平等有关。

【参考文献】
  　[1] 李 丽, 刘东阳, 江 骥，等. 灯盏乙素药理学研究进展[J]. 中草药, 2006, 37(8): 171.

　　[2] 郭菁菁, 杨秀芬. 黄酮类化合物对动物实验性肝损伤保护作用研究进展[J]. 中国药理学通报, 2008, 24 (1): 5.

　　[3] Yang XF, He W, Lu WH. Effects of scutellarin on liver function after brain ischemia/reperfusion in rats[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2003, 24 (11): 1118.

　　[4] 杨秀芬, 郭菁菁. 灯盏乙素对异烟肼和利福平合用所致小鼠肝损伤的保护作用[J]. 中国新药杂志, 2008,17 (14): 1209.

　　[5] 杨秀芬, 庞紫妤, 周 芳, 等. 灯盏乙素对小鼠免疫性肝损伤的保护作用[J]. 时珍国医国药, 2007，18 (4): 822.

　　[6] Zhang GL, Wang YH, Ni W, et al. Hepatoprotective role of Ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J].World J Gastroenterol, 2002, 8 (4): 728.