高效液相色谱法测定解毒利尿颗粒中甘草酸含量
作者：杜树山，张铮，张海鸣，沈圣民，曹杰，关铭
【摘要】 目的建立解毒利尿颗粒中甘草酸含量的高效液相测定方法。方法采用DiamonsilTM C18柱(250mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-[0.02 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(33∶1)](64∶36)为流动相，流速为1 ml·min-1;柱温30℃;检测波长250nm。结果甘草酸在0.15～0.75 μg范围内呈良好的线性关系(r=0.999 8)，该方法平均回收率为98.99%，RSD为1.74%(n=6)。结论该方法简便、稳定易行、准确、重现性较好，结果可靠，可为解毒利尿颗粒的质量评价提供有效依据。
【关键词】 高效液相色谱法; 解毒利尿颗粒; 甘草酸
Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of glycyrrhizic acid in Jiedu Liniao granules by HPLC. MethodsDiamonsilTM C18 column (5 μm,250mm×4.6 mm) was used with methol-(0.02 mol·L-1 ammonium acetate-glacial acetic acid(33∶1))(64∶36) as mobile phase.The flow rate was 1.0 ml·min-1，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 250nm.ResultsThe calibration curve were linear within the range of 0.15～0.75 μg(r=0.9998).The average recovery rate was 98.99%(RSD=1.74%). ConclusionThe method is convenient,stable and accurate,so it can be used for determination of glycyrrhizic acid in Jiedu Liniao granules.
Key words：HPLC; Jiedu Liniao Granules; Glycyrrhizic acid
解毒利尿颗粒由生甘草、白茅根、赤芍、紫苏叶、生姜、猪苓等6味药材组成，具有清热解毒、利尿等功效，临床上主要用于不明原因的中毒，因本品具有减轻中毒症状的作用，可为临床诊断确定中毒原因提供时间。甘草为本复方制剂中的君药，甘草酸是该药的主要有效成分，具有抗炎、解毒、保肝和增强免疫等作用[1]，因此本实验以甘草酸为指标进行含量测定，对本品进行质量控制。
目前，甘草酸的含量测定方法有高效液相色谱法[2]、薄层扫描法[3]和高效毛细管电泳法[4]和光纤近红外光谱法[5]等，因高效液相色谱法具有方法简便、稳定、重现性好等优点，故本研究采用此法测定解毒利尿颗粒中甘草酸的含量，旨在达到对本品进行质量控制的目的。
1 仪器与试药
Waters1525高效液相色谱仪(配Waters2487紫外可见检测器)，MeLLennium32色谱工作站;KQ-250DB数控型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司);METTER Toledo AG135 1/10万电子分析天平(瑞士METTER公司)。
甘草酸铵(中国药品生物制品检定所，批号：110731-200511)。解毒利尿颗粒样品(自制，批号：20060811，20060813，20060816)。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为DiamonsilTM C18 (250mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-[0.02 mol·L-1醋酸铵-冰醋酸(33∶1)](64∶36);检测波长250 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温30℃。进样量10 μl。根据试验结果，考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，规定理论板数按甘草酸峰计算，应不低于2 000。
2.2 对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的甘草酸铵对照品1.25 mg，置25 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升含甘草酸铵50 μg，相当于甘草酸48.975 μg)。
2.3 供试品溶液的制备 取本品(批号20060811)5袋，粉碎，称取0.5 g，精密称定，置100 ml的量瓶中，加40%甲醇稀释至刻度，超声提取40 min，静置，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
2.4 阴性供试品溶液的制备 按解毒利尿颗粒的处方，取除甘草提取物外的其他辅料依照本品制备工艺制备阴性样品制剂。取阴性样品制剂0.5 g，精密称取，按供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液。
2.5 系统适应性试验 按供试品测定方法进行测定。结果表明，甘草酸对照品与解毒利尿颗粒中甘草酸的保留时间一致，阴性供试品溶液在甘草酸色谱峰位置处无相应的峰出现，同时与其他组分分离完全，分离度为2.04，理论板数按甘草酸峰计算应不低于2 000。结果见图1。
2.6 线性关系考察 分别精密自动吸取此溶液3，5，8，10，13，15 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以进样量X(μg)对峰面积的积分值Y进行线性回归，计算回归方程：Y=784 579X-19 762(r=0.999 8)，试验结果表明甘草酸铵进样量在0.15～0.75 μg范围内线性关系良好。
A甘草酸铵对照品 B供试品 C阴性对照 1.甘草酸