鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究

              作者：幺宝金，赵雨，牛放，黄萍，杨菲，李娟

【摘要】  目的建立鹿角脱盘蛋白提取工艺。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，考察不同pH值、不同料液比、不同浸提时间、不同盐浓度等影响因素对蛋白提取效果的影响。结果鹿角脱盘蛋白的提取工艺为：pH值12的缓冲液(含50 mM EDTA、0.5 M NaCl)浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。结论验证实验结果表明，鹿角脱盘总蛋白收率可达2%，纯度可达80%。优选出的工艺稳定、合理、可行。

【关键词】  鹿角托盘; 蛋白; 提取工艺

　　Abstract：ObjectiveTo establish the extraction process of proteins from Sika antler base. MethodsSDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), was used to study the impacts on protein extraction, including pH values, solid-liquid ratio, extraction times, salt concentration and other factors. ResultsThe extraction process was obtained as follows: the materials were extracted twice with pH12 buffer solution in which contained 50 mmol/L EDTA and 0.5 mol/L NaCl, each time adding 5 times amount of buffer solution and extracting 3 h. ConclusionThe yield of proteins can be up to 2%, and purity can also be up to 80%. The optimum process obtained is steady, reasonable and feasible.

　　Key words： Sika antler base;Proteins;Extraction process

　　鹿角脱盘(Sika antler base)作为鹿产品的一种，是雄性梅花鹿Cervw nippon Temminck额骨上的角根与由此而生的鹿茸之间的平环状突起物，具有补肝肾、益脾胃、强筋壮骨、镇痛散癖、行血消肿、软坚散结、消除乳房痞块之功效，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等[1]。

　　目前，对于鹿角脱盘的化学成分及药理作用研究并不深入，在很大程度上限制了鹿角脱盘产品的开发。在前期工作中，我们对鹿角脱盘蛋白进行了质谱分析和数据库检索，表明鹿角脱盘蛋白含有多种活性蛋白，如抗菌肽Cathelicidin、肽聚糖识别蛋白等。本课题针对鹿角脱盘中的蛋白及多肽类成分进行分离纯化和鉴定，结合其临床应用进行药理和药效学研究，为鹿角脱盘产品的进一步开发和利用提供科学依据。本文报道为鹿角脱盘蛋白的提取工艺部分。

　　1 仪器与材料

　　梅花鹿鹿角脱盘，购自吉林省东风药业有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、 十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、甘油、甘氨酸购自Sigma公司;过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)、考马斯亮蓝 R250(Coomassie Blue R250)、溴酚蓝购自Amresaco公司;低分子量标准蛋白质(包括6种标准蛋白，相对分子质量分别为97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4kDa)，购于中国科学院上海生物化学研究所;其它试剂均为分析纯。

　　TDL-5型台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);CP225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂);LL3000 型冷冻干燥机(德国Heto公司);高速离心机(Eppendorf公司);电泳仪、垂直板电泳槽(北京六一仪器厂)。

　　2 方法与结果

　　2.1 不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉12份，每份300 mg。分别加入pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的缓冲溶液，按料液比1∶10浸提，时间为3h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图1由图1可知，当pH值为12时，提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多。因此在浸提过程中选用pH值为12的缓冲溶液进行浸提。