缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响
1.8 神经元鉴定
用免疫组织化学法检测神经微丝蛋白(neurofilament protein 200，NF200)的表达，进行神经元鉴定。具体方法同上。
1.9 统计学处理
实验数据均采用SPSS 10.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间的均数比较采用oneway ANOVA及LSDt检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 神经元形态和存活率的变化
光镜下观察培养7 d左右的神经元，可见突起之间形成稀疏的网络连接，神经元大多以纺锤形(2个突起，称为双极神经元)和星形(有3个以上突起，称为多极神经元)为主，神经细胞胞体饱满，周围有光晕。当对神经元进行缺氧处理后，神经细胞形态出现损伤，表现为细胞突起断裂甚至脱落，胞体萎缩甚至消失，大量细胞凋亡。采用神经元特异性NF200免疫组织化学染色,对所培养的海马神经元进行纯度鉴定,神经元纯度达到95%左右。
为了证明KATP在缺氧时对神经元的保护作用，采用KATP特异性的激动剂和抑制剂处理细胞，实验发现预先加入KATP激动剂二氮嗪的实验组中多极神经元的百分比和神经元存活率都比单纯性缺氧组提高(P<0.01)，而预先加入KATP抑制剂甲苯磺丁脲的实验组中多极神经元的百分比和神经元存活率都比单纯性缺氧组降低(P<0.01)(图1，表1)。
2.2 缺氧海马神经原中ATP敏感性钾通道对Bax基因表达的影响
本实验选取了凋亡相关基因Bax，使用RTPCR方法检测其在各实验组中的mRNA水平变化。Bax的mRNA在常氧时有少量表达，缺氧时表达升高，当加入二氮嗪时Bax的mRNA表达水平与单纯缺氧时相比下降(P<0.01)，在缺氧+甲苯磺丁脲组中Bax的mRNA表达水平相对于单纯缺氧组也有提高(P<0.05)(图2和表2)。表1 不同处理组多极神经元百分率和存活率的变化表2 不同处理组基因Bax mRNA的表达水平
3 讨 论
KATP通道广泛表达在各种细胞上，调控多种生理活动。越来越多的研究表明,KATP通道在各种能量缺失情况下具有保持细胞活力、延缓细胞死亡的功能。缺氧作为一种重要的生理应激反应，自然也受到KATP的调控。缺氧时细胞内ATP浓度下降，引起KATP通道活化，通道开放，导致膜超极化，从而阻止钙超载，达到保护细胞的目的[2]。本实验结果也证明了KATP的开关对缺氧海马神经元的保护作用，缺氧时随着KATP激动剂和抑制剂处理，多极神经元的百分率和凋亡率也发生了相应的变化。
Bax[3,4]是Bcl2蛋白质家族成员之一，在常态时以单体的形式存在于细胞质中，当接受到死亡信号时Bax以多聚体的形式嵌入线粒体外膜，改变膜的通透性促进膜间隙中包括细胞色素C等促凋亡因子的释放。细胞色素C则可以与APAF1(凋亡蛋白酶活化因子)，Caspase9形成凋亡体，诱导细胞进入凋亡途径[5]。实验研究显示，将原代培养的海马神经元进行缺氧或缺氧+药物处理后，Bax也随之发生了相应的变化(图2)，推测KATP通道开放后抑制基因Bax的表达，从而保护海马神经元免于缺氧损伤。Bax的表达受到各方面的影响，其中p53是其主要的调控因子，在受到外界刺激时可以转录激活Bax的表达[6]。2006年Huang等研究发现缺氧时KATP可以促进p53的表达，推测KATP可能是通过调解p53表达来影响Bax，从而调节细胞凋亡[7]。
缺氧是一种非常重要的生理应激反应，在正常发育和肿瘤生长中都有着重要的作用。本实验首次将KATP通道与Bax联系起来，初步探讨了KATP对于缺氧神经元的保护机制。实验中采用的是1 d的SD乳鼠培养的海马神经元，这种新生鼠的神经元与成年鼠的神经元可能具有不同的功能。研究发现很多基因都是在个体出生以后开始被诱导表达的。Ying Xia等人的实验显示ATP敏感性钾离子通道在刚出生的大鼠脑中含量很少，在出生后2周内含量快速增加，至成年时达到最高峰[8]。因此有必要研究成年鼠中KATP是否具有同样的功能。
【参考文献】
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[3] LI P F,DIETZ R,VON H R. p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome cindependent apoptosis blocked by Bcl2 [J]. The EMBO Journal,1999,25:6027-6036.
[4] SUZUKI Y,IMAI Y,NAKAYAMA H,et al. A serine protease,HtrA2,is released from the mitochondria and interacts with XIAP,inducing cell death [J]. Mol Cell,2001,8(3):613-621.
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[6] KOUMENIS C,ALARCON R,HAMMOND E,et al. Regulation of p53 by hypoxia: dissociation of transcriptional repression and apoptosis from p53 dependent transactivation[J]. Mol Cell Biol,2001 ,21(4):1297-1310.
[7] HUANG Lianyan,LI Wenjun,ZOU Fei. Activation of ATPsensitive Kchannels protects hippocampal CA1 neurons from hypoxia by suppressing p53 expression[J]. Neuroscience Letters,2006,398(1-2):34-8.
[8] YING,DAVI Eisenman,GABRIEL G. Sulfonylurea receptor expression in rat brain: effect of chronic hypoxia during development [J]. Pediatric Research,1993,34 (5): 634-641.