人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定
作者：陈武，莫炜，张艳玲，宋钢，宋后燕
【摘要】 目的 研究人纤溶酶原 kringle 区缺失突变体(PLGΔK)的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法 采用7.5 L发酵罐对工程菌 PLGΔK/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 PLGΔK 等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S2403 分别测定PLGΔK 激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。 结果 7.5 L高密度发酵可获得约为400 mg/L培液的表达量，经三步纯化后制备的PLGΔK纯度大于96%。理化分析显示PLGΔK的等电点为7.5～7.8，分子量：27. 787 kD，比活性：23.6 U/mg。 结论 初步建立了PLGΔK的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。
【关键词】 毕赤酵母 kringle 区 纤溶酶原 缺失突变体 纯化
Abstract:Objective To investigate the expression,purification and characters of the kringle domain deletion mutant of human plasminogen(PLGΔK)in Pichia pastoris.Methods Fermentation at high density (A600>200) in a 7.5 L fermenter was carried out and PLGΔK was purified from the culture broth in a three stepprocess: ultrafiltration,gel filtration,ion exchange chromatography,and was lyophilized after dialysis. The IFE,HPLC and LCMS were used to detect its isoelectric point (IP),purity,and molecular weight (MW). The fibrinolytic activity and amidolytic activity were measured with fibrin plate and chromogenic peptide substrate S2403 respectively.Results Fermentation in 7.5 L scale yielded an expression level of approximately 400 mg PLGΔK per liter fermentation broth. Through three steps of purification,the PLGΔK had a purity of over 96%. The exact MW of PLGΔK was 27.787 kD examined by LCMS and its IP was 7.5-7.8.Conclusion A pilot expression and purification technology of PLGΔK in Pichia pastoris cultured at high density has been set up. The activities of intermediate production are comparable to that of plasminogen extracted from human plasma,indicating a good perspective in scale up and application.
Key words:deletion mutant; kringle domain; Pichia pastoris; plasminogen; purification
人纤溶酶原(plasminogen,PLG)是人体纤溶系统的主要成分，在体内经纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,PA)激活后，转变为纤溶酶 (plasmin,PLM)，不仅发挥溶栓作用，还参与体内一系列与蛋白水解有关的生理病理过程，如炎症、组织修复、排卵、肿瘤侵袭和转移等。长期以来，纤溶酶被认为是一种具有潜力的直接溶栓药物，但由于分子量大、结构复杂、富含糖链且易自身降解，采用大肠杆菌、哺乳动物细胞表达效率较低[1,2]，因此对PLG进行结构改造是近年来研究的热点。本室宋钢等采用毕赤酵母表达了一种纤溶酶原kringle 区缺失突变体(PLGΔK)，经激活后，具有较好的纤溶活性[3]。本实验在此基础上，深入研究了高密度发酵和纯化工艺，使其更适合大规模制备，并对其理化性质进行研究，为纤溶酶的开发利用提供了实验基础。
1 实验材料
毕赤酵母表达菌PLGΔK/GS115由实验室自行构建;纤溶酶、纤溶酶原、三肽化合物S2403 (L焦谷氨酰L苯丙氨酰L赖氨酸对硝基苯胺)购自Sigma公司;YNB、酵母提取物购自Difco公司;其余试剂均为国产分析纯;Sephacryl S100 HR、Superdex 75、 SPSepharose FF(美国Amersham Pharmacia公司);3 kD、50 kD超滤膜(Millipore Pellicon);Proflux M12超滤仪(Millipore);BIOFLO 3000型7.5 L发酵罐及C25kC型温控摇床(美国NBS公司)。
2 方 法
2.1 PLGΔK表达菌7.5 L罐批发酵
采用NBS 7.5 L发酵罐高密度发酵，发酵条件控制：温度29.5 ℃ (PID模式)，pH5.1 (PID模式)，溶氧(35.0±5.0)% (Agit模式)，搅拌300～700 r/min (D.O.模式)。
甘油补加：初始速率为0.6 mL·L-1·h-1，2 h内逐渐升高至9 mL·L-1·h-1，此后维持此速率，待A600达到150左右，停止补加甘油。
甲醇诱导：初始速率为1 mL·L-1·h-1，8 h内逐渐升高至12 mL·L-1·h-1，以后维持此速度，并根据溶氧值和pH值的变化，调整补加甲醇的速率，直至诱导20 h。
2.2 PLGΔK的分离纯化
发酵液以8 000 r/min,4 ℃离心 30 min，上清用截留分子量50 kD超滤膜除去残留菌体及沉淀，再以截留分子量3 kD超滤膜浓缩至原体积的1/10。
将浓缩液进行Sephacryl 100凝胶过滤层析 (层析柱100 cm×7.5 cm)，用0.025 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)洗脱，按吸收峰收集各组分，检测活性、SDSPAGE分析，合并活性组分再进行SPSepharose FF层析 ( 层析柱20 cm×5 cm)。先将SPSepharose FF层析柱用A液 (pH 6.0,0.025 mol/L枸酸缓冲液 ) 平衡，将上述凝胶过滤后合并液1 L上样，先以A液洗脱，至第一峰止，再以A液与B液(pH 6.0,0.025 mol/L枸橼酸缓冲液+1 mol/L NaCl)进行线形梯度洗脱，按吸收峰收集各组分，检测活性、SDSPAGE分析，合并活性组分、透析除盐、加赋形剂甘露醇(终浓度3%)，以0.22 μm的膜滤过除菌，分装、冻干，4 ℃冰箱保存。以上分离纯化过程采用Amersham Pharmacia 层析系统在4 ℃冷房中进行。
2.3 PLGΔK的鉴定
2.3.1 PLGΔK的纯度鉴定 冻干的蛋白样品复溶后稀释为1 mg/mL，色谱柱为C18300A(2.1 cm × 10 cm，3.5 μm )。色谱分离条件：流动相A(95% 水，5% 乙腈，0.05% TFA)，流动相B(5% 水，95% 乙腈，0.05% TFA)，30 min内A相由100%降到0%，B相由0%升高到100%，流速0.2 mL/min，样品室温度10 ℃，柱温20 ℃。
2.3.2 PLGΔK分子量的测定 采用LCMS测定PLGΔK分子量。LC方法同上，质谱检测条件：质谱源电压3.5 kV，毛细管电压28 V，质谱质量数范围800～2000。
2.3.3 PLGΔK的等电点的测定 采用固相pH梯度预制聚丙烯酰胺凝胶(T=5%，C=3%，pH 3～10，110 mm × 110 mm × 1 mm)，水平电泳的等电聚焦方法测定样品的等电点。电泳条件：100 V，15 min; 200 V， 15 min; 400 V， 60 min。至电流读数为0 mA。冻干的蛋白样品复溶后稀释为1.0 mg/mL，每孔上样 5 μL，考马斯亮蓝R250染色。