CpG ODN增强乙肝疫苗免疫反应的研究
作者：戴帆，董斌，郭晓磊，石碧珠，方丽娟，莫家琳，田素娟，孟民杰
【摘要】 目的 研究人工合成的CpG ODN对乙肝表面抗原的免疫增强效应，评价CpG ODN的佐剂效应。方法 将不同剂量特定的CpG ODN与乙肝表面抗原联合免疫小鼠，用ELISA检测小鼠乙肝表面抗体的滴度。结果 CpG ODN联合乙肝表面抗原免疫小鼠，在短期检测中，高剂量组能较快的达到检测阈，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(P<0.05)，在长期检测中，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(P<0.05)，检测值随CpG剂量的增高而增大。结论 CpG ODN增强乙肝表面抗原的免疫反应短期和长期都具有剂量效应。
【关键词】 CpG ODN 乙肝表面抗原 免疫佐剂 体液免疫
Abstract:Objective To investigate the effects of immunological enhancement of HBsAg with synthetic CpG oligodeoxynucleotides,evaluate the adjuvant effect of CpG ODN. Methods Mice were vaccinated with CpG oligodeoxynucledtides and HBsAg at different doses,and then titers of HBsAb in the blood serums of mice were detected with ELISA. Results CpG ODN and HBsAg immunize the BALb/c mice,the highdose group could be detected quickly in shot term,the levels of antibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P<0.05),in long term the levels of antibodies in groups which use different doses of CpG ODN and HBsAg were different in statics(P<0.05),the levels of antibodies were corresponded with the levels of CpG ODN (P<0.05).Conclusion The immunological effect of HBsAg was enhanced with CpG ODN as adjuvant in short and long terms.
Key words:CpG ODN; HBsAg; immunoadjuvant; humoral immunity
CpG基序是一种具有非特异性免疫刺激能力的DNA序列，为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列。CpG ODN (unmethylated CpG motifbased oligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpG ODN可刺激人类和多种动物产生自然免疫和获得性免疫，主要通过TLR9信号系统活化免疫系统，最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC细胞。CpG ODN能快速活化T、B细胞，诱导Th1型免疫反应并能促进抗原递呈细胞的增生和成熟[1]。现阶段我国对乙型肝炎的预防主要是通过注射乙型肝炎疫苗，但接种免疫过程中和接种免疫后会出现免疫较弱和不免疫现象[2,3]。所以，选择一种安全有效的免疫佐剂是增强免疫效果的有效途径。本文通过测定不同时间段的小鼠注射CpG ODN和乙肝表面抗原后的抗体滴度，评价CpG ODN作为免疫佐剂增强乙肝疫苗的免疫效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 BAL b/c小鼠，雄性，6周龄，体质量18～22 g，SPF级，购自中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)20040011。
1.1.2 试剂 血源性乙肝表面抗原购自上海前尘生物，CpG ODN 由本实验室保存。
1.2 动物分组及免疫方案
1.2.1 动物分组 50只BAL b/c小鼠根据随机分配表，随机平均分成5组：第1组为HBsAg和高剂量CpGODN联合免疫组，第2组为HBsAg和中剂量CpGODN联合免疫组，第3组HBsAg和低剂量CpGODN联合免疫组，第4组为HBsAg单用组，第5组为生理盐水对照组。各组饲养条件相同。
1.2.2 动物免疫 分别于第0、2、4周免疫BAL b/c小鼠，每次免疫剂量相同。第1组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和100 μg CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第2组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和1 μg CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第3组：尾静脉注射含2 μg HBsAg 和10 ng CpGODN生理盐水溶液，100 μL/只;第4组：尾静脉注射含2 μg HBsAg生理盐水溶液，100 μL/只;第5组：100 μL生理盐水/只。
1.3 乙肝表面抗原检测
1.3.1 血清采集 断尾后玻璃毛细管采血，室温自然凝固，常温离心后取上清，-20 ℃保存。
1.3.2 抗原检测 96孔板用碳酸氢钠缓冲液(15 mmol/LNa2CO3，355 mmol/LNaHCO3，pH 9.6)适当稀释的乙肝表面抗原包被，4 ℃过夜孵育。用含Tween20的PBS(0.1 mol/LPBS,0.1% Tween20)洗涤3次，每次间隔3 min，每孔加入100 μL经PBS(0.1 mol/L PBS,1% BSA)适当稀释的待测血清， 37 ℃孵育90 min。 PBS洗涤5次， 每孔加入100 μL
1 000倍稀释的HRP标记的乙肝表面抗原，37℃孵育40 min。PBS洗涤5次，每孔加入100 μL TMB底物(含0.1 mg/mL 3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH 5.4，用前加5 mL 30% H2O2 10 mL)，37 ℃孵育1 h。每孔加入100 μL H2SO2(0.2 mol/L)终止显色反应。BioRad 680 测定A450/630读数。
1.4 统计学分析
应用SPSS统计软件，采用重复测量方差分析对数据进行分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 小鼠免疫后7～28 d外周血中乙肝表面抗体的平均滴度变化
乙肝表面抗原单用组的抗体在7～17 d时间段内检测不到，乙肝表面抗原和低剂量CpG ODN联合免疫的抗体在第14天检测到，乙肝表面抗原和中剂量CpG ODN联合免疫组的抗体在第10天检测到，乙肝表面抗原和高剂量CpG ODN联合免疫的抗体出现时间较早，在第7天即可检测到。在第14～28天的各个时间点上，乙肝表面抗原和高剂量CpG ODN联合免疫组的抗体滴度均显著高于乙肝表面抗原和中剂量CpG ODN联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量CpG ODN联合免疫组(P<0.05);在第14、17、21天时间点上，乙肝表面抗原和中剂量CpG ODN联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量CpG ODN联合免疫组之间差异无显著性(P<0.05)，在第24、28天时间点上，两组差异有显著性 (P<0.05);在第21、24、28天时间点上，乙肝表面抗原和中剂量CpG ODN联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量CpG ODN联合免疫组的抗体滴度均显著高于乙肝表面抗原单用组(P<0.05)。见图1和表1。表1 免疫7～28 d HBsAb滴度对数转换数据