SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库
作者：朱碧云，高蓝，黄欣，李浩明
【摘要】 目的 构建红曲霉cDNA文库，为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。方法 采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库， 经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。结果 原始文库的库容为2.03×105，重组率达94%。插入片段大小多在0.7～2.0 kb，平均大小在1 kb左右。结论 所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。
【关键词】 红曲霉菌 cDNA文库 SMART
Abstract:Objective Construction of Monascus cDNA Library provide foundations for the research of Monascus functional genes and screening,cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in Monascus.Methods A cDNA library was constructed based on SMART system. The number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment was determined by PCR. Results The primary library capacity was 2.03×105，average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. Conclusion The library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins.
Key words: Monascus; cDNA Library; SMART
红曲霉菌(Monascus)是我国重要的微生物资源，其应用已有上千年的历史。红曲菌在发酵过程中能产生多种重要生物活性物质，具有降血脂、降血压、抗氧化、抗癌、抗菌、防治骨质疏松和保护肝脏等多重功效。明代李时珍的《本草纲目》中记载了红曲的药用价值——“消食活血，健脾燥胃，治赤白痢下水谷，酿酒，破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤，治女人血气痛及产后恶血不尽，擂酒饮之，良。” 红曲霉的早期研究主要集中于其所产的红曲色素和各种酶类，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶等，因此早期红曲霉主要用于食品着色、酿酒、食品发酵等。1979年日本学者Endo[1]从泰国出产的红曲米中分离筛选出具有降脂作用活性成分Monacolin K(又称Lovastatin，洛伐他汀)的红曲霉之后，对红曲功能食品的研发活跃起来，我国相继开发出“血脂康”、“脂必妥”等多种红曲功能食品[2]，Moncolin K生物合成相关基因也被克隆与分析[3]，红曲霉的研究进入分子水平。
全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的一种重要方法之一[4]。全长cDNA有助于鉴定其基因组序列中的外显子内含子的边界，分析基因编码区和理解基因在转录和翻译水平的功能，是分析真菌基因表达图谱、功能和结构的重要资源。构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一，在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用。本文利用SMART方法构建了红曲霉全长cDNA文库,为进一步开发利用红曲霉奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
安卡红曲霉(Monascus anka)CICC 5031，由中国工业微生物菌种保藏中心保存;Trizol提取试剂购自美国Invitrogen公司;Creator SMART cDNA文库构建试剂盒购自美国Clontech公司;质粒小量提取试剂盒、PCR Taq Mix试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取
接种红曲霉于土豆培养基(PDL)中，30 ℃，170 r/min，培养5 d至产生红曲色素。将菌液离心，沉淀分别用蒸馏水、无菌水、DEPC水润洗，干燥，称干重，将样品放于研钵中，加入液氮，研磨至粉状。在样品未融化前加入Trizol reagent，继续研磨使样品溶解。离心，取上清。加氯仿，摇匀，离心，取上清。加异丙醇沉淀RNA。75%(φ)乙醇洗涤沉淀，风干RNA，用无RNase水溶解沉淀，-70 ℃保存。得总RNA。使用紫外分析仪检测总RNA浓度、纯度，1.1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.2.2 双链cDNA的合成
广东药学院学报 第25卷 第3期 朱碧云，等.SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库 在5 μL反应体系中加入1.0 μg total RNA、SMART Ⅳ Oligonucleotide (5′AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′) 1 μL、CDS Ⅲ/3′PCR引物[5′ATTCTAGAGGCCGAG GCGGCCGACATGd(T)30 N-1N3′( N=A、G、C or T;N-1=A、G or C] 1 μL，用无RNase水补足到5 μL。混匀，短暂离心，72 ℃，2 min;冰上冷却2 min，短暂离心;向反应液中加入5×第一链反应缓冲液2.0 μL及20 mmol/L DTT、10 mmol/L dNTP混合液、MMLV逆转录酶各1 μL于42 ℃孵育60 min，置于冰浴中终止反应。取2 μL第一链产物于干净预冷0.2 mL反应管中，进行PCR扩增。引物为5′PCR引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)、CDSⅢ/3′PCR引物。循环条件为：首先把PCR仪预热到95 ℃，再20个循环：95 ℃ 15 s，68 ℃ 6 min。1.1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并估算其浓度。
1.2.3 cDNA 的分级分离纯化及文库构建
合成的双链cDNA经蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切后，柱层析分级，共收集15管，每管取3 μL进行1.1%琼脂糖电泳检测，合并能显示亮带的前4管(片段>0.4 kb)，进行沉淀，重悬在去离子水中，加T4DNA连接酶，与质粒载体pDNRLIB(经SfiⅠ酶处理过)于16 ℃下连接过夜。cDNA与载体的比例为1.5∶1。连接产物经电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。电击条件：电击杯内径0.1 cm，电容25 μF，电阻200 Ω，电压1.8 kV，感受态25 μL,电转仪：BIORAD Gene Pulser Xcell 电穿孔仪。将转化产物转移到加有1 mL LB培养基的试管中，225 r/min，37 ℃，培养1 h。