补骨脂汤对痴呆大鼠海马NR2B、BDNF/TrkB表达的影响
2.5 半定量的RT-PCR
按照TRIZOL试剂说明书提取总RNA，在20μl反转录反应体积中进行反转录，合成cDNA。取上述逆转录产物PCR扩增NR2B、BDNF、TrkB。NR2B：Forward primer:5’GCTCAGCGACCTGTATGG3’，Reverse primer:5’AGGCGAGTTCTCCTTTGTT3’，产物长度331bp；BDNF：Forward primer:5’TTATTTCATACTTCGGTTGC3’， Reverse primer:5’ATGGGATTACACATTGGTCTC3’,产物长度547bp； TrkB：Forward Prime:5’GGCTTATGCTTGCTGGTC3’,Reverseprimer:5’CTGGGTCAATGCTGTTAGGT3’,产物长度148bp。25 μl PCR反应体系中进行PCR反应（NR2B mRNA、BDNF mRNA、TrkB mRNA:95℃ 5min, 94℃ 30s, 53℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min；GAP-43mRNA：95℃ 5min, 94℃ 30s, 55℃ 20s,72℃ 30s,30个循环，72℃终延伸5min ）。PCR产物用2﹪琼脂糖凝胶溴化乙锭电泳分离，用凝胶图形分析系统进行拍照，观察结果并测定灰度值，以扩增的目的条带和同时扩增的β–actin的灰度值比对各基因转录水平进行衡量。
2.6 统计学处理数据采用±s表示，应用应用SPSS15．0统计软件，组间比较采用方差分析及q检验。
3 结果
3.1 补骨脂汤对血管性痴呆大鼠空间学习记忆的影响
给药30 d后，进行Morris实验，结果见表1 ，从表1数据可以看出，各大鼠在游泳测试中，其逃避潜伏期都随游泳天数的增加逐渐下降，且前三天的的逃避潜伏期下降速度比较快，后三天的潜伏期逐渐稳定下来。而且，与模型组相比，补骨脂汤的高、低剂量组和银杏叶片组的逃避潜伏期都有明显的缩短（P﹤0.01），表明补骨脂汤和银杏叶片对血管性痴呆大鼠的空间记忆都有明显的改善作用。且补骨脂汤的高、低剂量组的逃避潜伏期比银杏叶片组有明显的缩短（P﹤0.01），表明补骨脂汤改善血管痴呆大鼠的空间记忆的作用要优于银杏叶片。表1 各大鼠在Morris水迷宫实验中的空间辨别记忆的逃避潜伏期（略）
3.2 补骨脂汤对血管性痴呆海马内NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达的影响
用RT-PCR的方法对NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达水平进行分析，发现:与模型组比较,补骨脂汤无论是高剂量，还是低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达（P<0.05）,而银杏片组只提高了BDNF/TrkB mRNA表达水平(P<0.05)；尽管补骨脂汤组与银杏片组无明显差异（P>0.05），但补骨脂汤促NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达水平要高于银杏片(表2)。表2 补骨脂汤对血管性痴呆海马内NR2B、BDNF/TrkBmRNA表达的影响（略）
4 讨论
中医认为，VaD的发病病位在脑，属本虚标实之证，本虚即气虚、肾虚；标实是指痰浊、瘀血、浊毒。本虚标实相互夹杂、影响、转化，复加饮食、情志、劳逸等因素，而致脏腑功能失调，气滞血瘀，浊毒内生，脑气脏气不相顺接 ，脑髓失养而成本病［4］。
根据该疾病的病机，本实验室选用补骨脂汤治疗血管性痴呆大鼠，发现：补骨脂汤的高、低剂量组的逃避潜伏期都有明显的短于模型组，说明补骨脂汤能明显改善血管性痴呆大鼠的空间记忆（P<0.01）。这可能是补骨脂汤中的人参大补元气，使气旺精足，安神益智；补骨脂、益智仁、苁蓉、熟地具有补肾填精功效；远志能祛痰开窍；大枣、当归具有益气作用；丹参有活血行气祛瘀通络的作用。诸药合用，使其具有补肾精、益气血、活血化痰的作用，从而改善了大鼠的空间学习记忆［2，3］。
为进一步阐明该方的作用机理，本实验对海马内影响空间学习记忆的NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物进行分析，发现：补骨脂汤无论是高剂量，还是低剂量，均可明显提高NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达，提示：补骨脂汤改善痴呆大鼠的空间学习记忆可能与NR2B、BDNF/TrkB基因表达产物有关。因为在哺乳动物中枢神经系统中，由 NMDA受体介道的兴奋性神经传导在生理、病理过程中发挥重要作用，也是人类治疗神经疾病希望的靶点，通过NMDA受体的激活作用调节基因表达，会影响神经发育、突触可塑性及学习记忆，含NR2B和NR2A的NMDA受体相互藕联产生明确的细胞内的信号转导，导致了的BDNF的表达和细胞外信号调节激酶1/2激活［5～7］。但方中的哪些成分是影响NR2B、BDNF/TrkB mRNA表达，从而改善血管性痴呆大鼠空间学习记忆，目前尚不清楚，将是今后研究的重点，也是中药现代化研究的重要方面。
【参考文献】
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［2］郑里翔,汪 敏,辛增平.补骨脂汤对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆行为学的影响［J］.江西中医学院学报，2007 ，2：67.
［3］郑里翔，汪 敏，辛增平.补骨脂汤对血管性痴呆大鼠海马内C-FOS基因表达及学习记忆的影响［J］.中医药学刊,2006，24（5）：278.
［4］闫敬来,陈燕清.老年痴呆病机的中医学认识概述［J］.中华中医药杂志,2008，23（7）：168.
［5］Jennifer J. Brightwell, Clayton A. Smith,et al.Long-term memory for place learning is facilitated by expression of cAMP response element-binding protein in the dorsal hippocampus［J］. Learn. Mem,2007 14: 195.
［6］David L, Nishchal S, Edi B,et al.Learning in the absence of experience-dependent regulation of NMDAR composition［J］. Learn. Mem,2006 13: 566.
［7］Mariana Alonso, Jorge H. Medina, et al.ERK1/2 Activation Is Necessary for BDNF to Increase Dendritic Spine Density in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons［J］.Learn. Mem, 2004 11: 172.
