红毛五加中多糖的含量
2.4 工作曲线的制备
精密量取对照品稀溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置25 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀。精密量取以上系列对照品溶液各2 mL,分别置10 mL量瓶中,各加入DNS试液1.5 mL,摇匀,置沸水浴中加热5 min,取出,立即放入冰水中,冷却30 min,加水至刻度；以相应的溶液为空白,照分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录VB],在520 nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程：A＝5.678 40C－0.229 23,相关系数r＝0.999 2,说明在浓度46.6～233.0 mg/L范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
取还原糖供试品溶液2 mL,依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0.249 77、0.249 94、0.250 03、0.249 89、0.250 17、0.250 21,平均为0.250 0,RSD＝0.068%(n＝6),说明仪器性能良好,操作是精确的。
取总糖供试品溶液2 mL,依法重复测定6次。结果吸收度值分别为0.552 87、0.553 12、0.552 96、0.554 37、0.554 55、0.554 66,平均为0.553 8,RSD＝0.15%(n＝6),说明仪器性能良好,操作是精确的。
2.6 稳定性试验
取还原糖供试品溶液2 mL,按样品测定项下依法测定,间隔一定时间测定1次,共测0～4 h,测得吸收度值分别为0.249 77、0.251 10、0.249 53、0.248 06、0.246 35、0.241 70、0.236 91,平均为0.246 20,RSD＝2.08%(n＝7),说明还原糖供试品溶液在4 h内是稳定的。
取总糖供试品溶液2 mL,按上法测定,测得吸收度值分别为0.552 87、0.571 17、0.573 49、0.575 59、0.565 75、0.575 12、0.578 70,平均为0.570 38,RSD＝1.53%(n＝7),说明总糖供试品溶液在4 h内是稳定的。
2.7 重复性试验
取同一批号样品5份,按还原糖供试品溶液制备方法制备,依法测定,计算还原糖含量分别为5.801%、6.048%、6.123%、6.003%、6.207%,还原糖平均含量为6.04%,RSD＝2.53%(n＝5),说明本方法重复性好。
取同一批号样品5份,按总糖供试品溶液制备,依法测定,计算总糖含量分别为19.453%、20.588%、19.665%、19.830%、19.318%,总糖平均含量为19.77%,RSD＝2.51%(n＝5),说明本方法重复性好。
2.8 回收率试验
2.8.1 还原糖
分别精密称取同一批样品约17 mg,5份,各精密加入1.033 2 mg/mL的对照品溶液1.0 mL,同时称取2份样品(每份约35 mg)随行对照测定其含量。按测定法进行测定,结果见表1。随行样品测得还原糖含量平均值为6.03%。结果显示,平均回收率为99.0%,RSD＝3.52%。说明本方法可行。表1 还原糖加样回收试验（略）
2.8.2 总糖
分别精密称取同一批样品约17 mg,5份,各精密加入1.033 2 mg/mL的对照品溶液3.5 mL,同时称取2份样品(每份约35 mg)随行测定其含量。按测定法进行测定,结果见表2。随行样品测得总糖含量平均值为19.77%。结果显示,平均回收率为102.1%,RSD＝3.53%。说明本方法可行。表2 总糖加样回收试验（略）
2.9 3批样品含量测定
(见表3)表3 3批药材总多糖测定结果（略）经3批样品含量测定结果表明,红毛五加药材中总多糖含量为1.3～1.9 mg/g。
3 讨论
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。单糖都是还原糖,对于多糖可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖含量(还原糖以葡萄糖含量计),以总糖含量减去还原糖含量,即为总多糖的含量。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物,DNS则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比,利用分光光度计,在520 nm波长下测定光密度值,查对标准曲线并计算,可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时,每断裂一个糖苷键需加入一个水分子,所以在计算总多糖含量时应乘以0.9。
本试验运用DNS法测定样品中还原糖和总糖的含量,可计算出样品中具有生物活性的总多糖的含量。而通常运用的苯酚-硫酸法及蒽酮法均是测定总糖含量,因方法局限性无法用该方法测定还原糖(单糖)的含量,则不能明确表明其中多糖的含量,因此,DNS法可同时方便地测还原糖和总糖的含量,具有独到的实用性。在本试验多糖的分离与提取中,选用70%乙醇浓度进行醇洗步骤,是通过DNS法对不同乙醇浓度(40%、60%、70%、80%)提取总糖及还原糖的收得率的比较,计算出总糖的多寡,权衡做出适宜的选择。
本试验条件选择中,样品称样量的大小以及总糖水解时加热时间长短至关重要,称样量一般宜30～40 mg。总糖供试液制备过程中加盐酸溶液(1→2),水浴中水解时间长短对含量测定有影响,水解时间过短(3～5 min)则可能水解不完全,时间过长(大于20 min)则检出总糖含量下降,并随时间加长下降加速,其原因是单糖进一步水解为5-羟甲基糠醛,不能与DNS缩合成有色物质,再者可能水解后的单糖再发生聚合所致总糖含量有明显下降趋势。因此,本试验水解时间需严格控制,否则会影响测定结果的准确性。
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