红毛五加中多糖的含量

               作者：章丽华　张利平　胡锦群　冯丽娟　张龙清　张莅峡

【摘要】  ：目的 建立红毛五加中多糖的含量测定方法。方法 采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法),测定红毛五加中的还原糖和总糖的含量,并计算出总多糖的含量。结果 以葡萄糖为对照品,线性范围为46.6～233.0 mg/L(r＝0.999 2),加样回收率为99.0%～102.1%；红毛五加中总多糖含量1.3～1.9 mg/g。结论 本方法灵敏、稳定、重复性好,有助于红毛五加质量控制方法的研究。

【关键词】  红毛五加多糖　葡萄糖　3,5-二硝酸水杨酸比色法

　　Abstract：Objective To establish a method for the quantitative determination of AGP (Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides). Methods AGP content was determined by DNS Method. The absorptions of processed samples were tested at the wavelength of 520 nm. Results Contrast to glucose, the linear range was 46.6～233.0 mg/L (r＝0.999 2), the average recovery was 99.0%～102.1%, RSD＝3.52%, n＝5. The polysaccharides measured in 3 batches of samples were 1.3～1.9 mg/g. Conclusion The method is sensitive, steady with good repeatability, and help to the qulity control of Acanthopanax giraldii Harms.

　　Key words：Acanthopanax giraldii Harms polysaccharides (AGP)；glucose；DNS method

　　红毛五加(Acanthopanax giraldii Harms)是五加科五加属植物,主产于我国四川省[1-2]。四川省的红毛五加资源丰富,蕴藏量大,每年春天采收茎枝后,翌年仍生长茂盛。红毛五加与其它五加科植物不同,药用部位为茎皮,这对野生植物资源的保护无疑是十分有益的。我国已故著名的生药学家楼之岑先生在《常用中药材品种整理和质量研究》一书中建议将红毛五加列为《中华人民共和国药典》品种[3],目前尚未实现,但研究工作在不断深入,近几年来对红毛五加的研究进展较快,取得许多成果。化学成分研究表明,红毛五加主含挥发油、皂苷类、木脂素类、核苷类、多糖类、氨基酸、有机酸及微量元素等多种活性成分。药理作用研究证实,其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗辐射、保肝、调节心脑血管及机体免疫功能作用等[4-7]。红毛五加活性成分之一的多糖类对免疫调节作用、抗肿瘤及抗病毒作用尤为突出,并在临床得以证实[8]。为有效地控制药材质量,一般选用苯酚-硫酸法或硫酸蒽酮比色法[9-10]进行总糖测定,因总糖中包括单糖和多糖,不能明确地表明其中的多糖含量。另外,硫酸具有较强的腐蚀性,给实验操作带来极大不便。本试验采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)[11-12],以葡萄糖作为对照品,通过测定总糖及还原糖的含量,计算出多糖含量。本法灵敏、稳定、重复性好,适用于含多糖类中药的质量控制研究。

　　1  材料

　　1.1  多糖的分离与提取
   
　　取红毛五加皮,经粉碎,过40目筛,称取500 g,加适量水湿润2 h,装入渗漉筒中,加水浸没药材,浸渍6 h后,开始渗漉。以5 mL/(min·kg)的漉速渗漉,收集8倍量的渗漉液,减压浓缩至相对密度1.04～1.06(室温)。加乙醇沉淀,使最终含醇量达70%,静置,分层后分离,取醇沉物进行真空干燥(60 ℃以下),得浅黄色红毛五加多糖提取物,经3批红毛五加多糖提取,其提取率分别为1.40%、1.20%、1.41%。

　　1.2 仪器、试剂及药材
   
　　UV-2550型紫外-可见分光光度计,SHIMADZU(日本)生产。
   
　　无水葡萄糖(含量测定用,批号0833-9501),中国药品生物制品检定所提供；3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂,上海润捷化学试剂有限公司产品；所用其它化学品试剂均系分析纯。
   
　　DNS试液的配制：称取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液,加到500 mL含有182 g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠,搅拌溶解,冷却后加蒸馏水定容至1 000 mL,贮于棕色瓶中,7 d后使用。

   　 红毛五加药材购自成都市,由中国中医科学院中药研究所谢宗万研究员鉴定为红毛五加茎皮。

　　2  方法与结果

　　2.1  溶液的制备

　　2.1.1  对照品浓溶液的制备 

　　精密称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量,置50 mL容量瓶中(1 mg/mL),加水定容至刻度,混匀,置4 ℃冰箱保存备用。

　　2.1.2  对照品稀溶液的制备 

　　分别取上述浓对照品液若干(1～5 mL)置25 mL容量瓶中,用水稀释至刻度,混匀,备用。

　　2.1.3  还原糖供试品溶液的制备

　　精密称取本品约40 mg,置25 mL量瓶中,加适量水振摇,使其充分溶解,并用水稀释至刻度,摇匀,过滤,弃初滤液,取续滤液,备用。

　　2.1.4  总糖供试品溶液的制备 

　　精密称取本品约40 mg,置50 mL磨口三角瓶中,加盐酸(1→2)10 mL,置沸水浴中10 min,取出放冷后,加40%氢氧化钠溶液调pH至中性,移入50 mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,过滤,弃初滤液,取续滤液,备用。

　　2.1.5  空白溶液的制备
 
　　取蒸馏水,与对照品溶液同时同法处理即可。

　　2.2  样品测定

   　 精密量取上述对照品稀溶液、还原糖、总糖供试品溶液及空白溶液各2 mL,分别置10 mL容量瓶中,各加入DNS试液1.5 mL,摇匀,置沸水浴中加热5 min,取出,立即放入冰水中,冷却30 min,加水至刻度,摇匀,照分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录VA]在520 nm波长处分别测定吸收度,计算总多糖的含量,即得。

　　2.3  DNS比色法试验条件的选择

　　2.3.1  检测波长的选择 

　　分光光度计经空白溶液校准后,先后取上述对照品溶液、还原糖供试品及总糖供试品待测溶液进行全波段(360～900 nm)扫描,结果经比较分析,考虑取干扰较少、测定稳定且灵敏度较高的520 nm作为测定波长为宜。

　　2.3.2  称样量大小对测定还原糖及总糖的影响 

　　参照“2.2”项测定,除称样量大小改变外,其它测定条件不变。结果表明,称样量取30～40 mg范围影响不大。称样量过大,造成溶解不好或水解不完全；称样量过小,吸光度过小,超出仪器最佳范围,易造成测定不准确误差,称量最适宜范围为30～40 mg。

　　2.3.3  总糖供试品溶液加酸水解时水浴加热时间考察 

　　参照“2.2”项样品测定法,总糖供试品溶液加酸水解水浴加热时间改变,其它条件不变情况下,观察对总糖含量测定的影响。结果表明,总糖供试品溶液制备过程中,加盐酸溶液(1→2),在水浴中水解时间长短对测定有影响。时间过短水解不完全,时间过长则检出含量下降,拟选择10 min为宜。