高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷的含量
2.6 重复性试验
精密称取同一批号5份样品,按供试品溶液制备方法制备,进样,记录峰面积,结果绿原酸RSD＝1.48%,黄芩苷RSD＝1.53%,连翘苷RSD＝1.34%,汉黄芩素RSD＝1.58%,表明方法重复性良好。
2.7 阴性对照试验
分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,绘制色谱图。结果阴性对照溶液在供试品溶液及对照品溶液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素保留时间相应位置上均无吸收峰出现,表明阴性对照无干扰。
2.8 加样回收率试验
精密量取同一批号0.2 mL双黄连口服液4份于50 mL容量瓶中,分别加入绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品溶液适量,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤。按“2.1”项下色谱条件进样测定其含量,计算加样回收率,结果见表1。表1 绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素回收率测定结果(略)
2.9 样品含量测定
取3批样品,按“2.2.2”项下方法分别制成供试品溶液,精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,用外标法计算样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的含量,结果见表2。表2 样品含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 供试品溶液制备方法的选择
2005版《中华人民共和国药典》(一部)高效液相色谱法测定绿原酸的含量时对供试品溶液处理采用加水稀释样品的方法,测定黄芩苷的含量时采用50%甲醇超声处理20 min,测定连翘苷的含量时采用过中性氧化铝柱洗脱。文献报道也多采用上述方法[3-6]。我们在试验中观察到：50%甲醇超声处理20 min与50%、100%甲醇溶解、过滤所得色谱峰的峰面积结果无明显区别,而溶解过滤操作更为简便易行,所以,选择甲醇溶解过滤供试品。制备供试品溶液使用纯甲醇和50%甲醇做溶剂所得色谱峰的峰形、峰面积均无明显区别,从节约成本的角度出发,本试验最终选择50%甲醇溶解、过滤制备供试品溶液。
3.2 检测波长的选择
本试验对绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素4种对照品进行了200～400 nm紫外光谱扫描,结果表明,绿原酸在218 nm处有较强的吸收,在240 nm和295 nm处有次强吸收；黄芩苷在278 nm处有较强的吸收,在315 nm处有次强吸收；连翘苷在228 nm处有较强的吸收,在278 nm处有次强吸收；汉黄芩素在278 nm处有一个最大吸收峰。考虑到连翘苷和汉黄芩素在样品中含量较低,而绿原酸和黄芩苷在样品中含量较高,为了提高连翘苷和汉黄芩素检测灵敏度,以选择汉黄芩素的最大吸收波长278 nm作为检测波长,提高汉黄芩素的检测灵敏度,减少4个成分峰之间峰高的差别。
3.3 流动相的选择
我们在试验中发现,甲醇与水混合压力明显增高,而乙腈同样与水混合并不如此。与甲醇相比,乙腈的洗脱能力强,且粘度较小,柱压大小比较合适,可以满足色谱系统流速在1.0 mL/min条件下检测的要求,并且系统分离效果较好,峰形对称,柱效高,保留时间适宜。因此,综合来看,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。试验中观察到,乙腈-磷酸比乙腈-水做流动相所得的色谱峰要稍微敏锐,拖尾减少。而且,我们曾经尝试对磷酸的浓度进行0.1%～1.0%调节,发现在此范围内对峰形的变化无明显影响,从保护色谱柱的角度考虑,决定采用乙腈- 0.2%磷酸溶液作为流动相。
3.4 洗脱方式的选择
本制剂为中药复方,成分较复杂,且黄芩苷与汉黄芩素分别为黄酮苷和黄酮苷元,极性差别较大,采用等度洗脱法难以达到有效分离。曾选用乙腈-0.2%磷酸(30∶70)的色谱条件,绿原酸与邻近组分分离效果不佳,而汉黄芩素的对照品在40 min左右出峰,保留时间明显延长,样品溶液在同一保留时间里未发现相应的色谱峰。采用梯度洗脱的方法,在检测过程的前6 min保持乙腈的比例为27%,使绿原酸与邻近组分达到基线分离；6～25 min将乙腈的比例逐步提高到90%,一方面缩短汉黄芩素的出峰时间,更重要的是通过大幅度增加乙腈的浓度来提高洗脱效果,结果汉黄芩素对照品在22.5 min左右出峰,供试品与对照品在同一保留时间里有一相应的色谱峰,分离效果较好,峰形对称。在此条件下,黄芩苷和连翘苷的保留时间适宜,峰形对称,分离度好,从而可以将上述4种成分同时测定。
【参考文献】
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