高效液相色谱法测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷的含量

【摘要】  ：目的 建立同时测定双黄连口服液中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素含量的高效液相色谱法。方法 采用VP-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm。结果 绿原酸在0.44～6.60 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为97.0%；黄芩苷在0.52～6.18 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为98.98%；连翘苷在0.20～2.04 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 3),平均回收率为103.55%；汉黄芩素在0.13～1.76 μg范围内线性关系良好(r＝0.999 1),平均回收率为96.49%。结论 本方法简便可行、准确、快速,可用于双黄连口服液中上述4种成分的含量测定。

【关键词】  双黄连口服液　绿原酸　黄芩苷　连翘苷　汉黄芩素　高效液相色谱法　含量测定
   
　　Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of chlorogenic acid, baicaliin, forsythin and wogonin in Shuanghuanglian oral liquid. Methods The column was VP-ODS C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was at 278 nm. Results The calibration curves were linear within the range of 0.44～6.60 μg (r＝0.999 1) for chlorogenic acid, 0.52～6.18 μg (r＝0.999 1) for baicaliin, 0.20～2.04 μg (r＝0.999 3) for forsythin (r＝0.999 3) and 0.13～1.76 μg (r＝0.999 1) for wogonin, respectively. The average recovery of them were 97.0% (RSD＝1.1%), 98.98% (RSD＝1.1%), 103.55% (RSD＝1.1%) and 96.49% (RSD＝1.1%), respectively. Conclusion The method is simple, practicable, accurate and rapid. It can be applied to content determination of chlorogenic acid, baicaliin, forsythin and wogonin in Shuanghuanglian oral liquid.

　　Key words：Shuanghuanglian oral liquid；chlorogenic acid；baicaliin；forsythin；wogonin；HPLC

    　双黄连口服液由金银花、黄芩及连翘经提取精制而成,具有辛凉解表、清热解毒功效,对于上呼吸道感染、扁桃体炎、咽炎、病毒性肺炎等细菌和病毒感染性疾病有一定疗效。其中绿原酸、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩素是其主要活性成分。2005年版《中华人民共和国药典》(一部)采用高效液相色谱法只测定了绿原酸、黄芩苷、连翘苷的含量[1],而且是采用包括甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸-水的不同流动相分别测定。本试验参照文献[2],通过优化色谱条件,建立了不经提取分离,利用梯度洗脱法同时测定上述4种成分含量的高效液相色谱法,具有简便可行、准确、快速的特点,减少了配制流动相的步骤和进样次数,提高了工作效率,取得了满意效果。

　　1  仪器与试药
   
　　岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10Avp紫外可见检测器；CLSS-VP色谱工作站；CTO-10ASvp柱温箱；7725i手动进样器。绿原酸对照品(批号110753-200212)、黄芩苷对照品(批号110715-200514)、连翘苷对照品(批号110821-200609)、汉黄芩素对照品(批号110514-200403)均由中国药品生物制品检定所提供。双黄连口服液由中国人民解放军252医院药剂科提供,批号20070115、20070121、20070212。甲醇、乙腈均为色谱纯,磷酸为分析纯,水为三蒸水。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适应性试验
   
　　色谱柱：岛津VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)(A＋B＝100%)作梯度洗脱, t＝0→6 min,A：27%；t＝6→10 min,A：30%；t＝10→15 min,A：60%；t＝15→25 min,A：90%；流速：1.0 mL/min；检测波长：278 nm；柱温：25 ℃；进样量20 μL。在上述色谱条件下,4种待测组分与邻近组分达到了基线分离,理论塔板数按绿原酸峰计算不低于3 000。

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备
 
　　精密称取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素对照品适量,置10 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别制成浓度为1.10、1.03、0.51、0.44 mg/mL的对照品母液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备 

　　精密吸取双黄连口服液1.0 mL,置50 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。

　　2.2.3  阴性对照溶液的制备 

　　按处方比例及制备工艺,分别制备缺金银花、黄芩、连翘的阴性对照样品,按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。

　　2.3  线性关系考察
   
　　分别精密吸取绿原酸对照品母液0.20、0.40、0.75、1.50、3.0 mL,黄芩苷对照品母液0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 mL,连翘苷对照品母液0.20、0.40、0.60、1.20、2.0 mL,汉黄芩素对照品母液0.15、0.25、0.50、1.0、2.0 mL,对应加入10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成5个浓度的混合对照品溶液,进样测定,记录色谱图。以峰面积为纵坐标,分别以绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素进样量为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程。绿原酸：Y＝1.04×107X＋1.40×105, r＝0.999 6；黄芩苷：Y＝3.87×106X－1.26×104,r＝0.999 9；连翘苷：Y＝6.44×105X＋1.74×104,r＝0.999 9；汉黄芩素：Y＝6.30×106X＋1.45×105,r＝0.999 9。结果表明,绿原酸进样量在0.44～6.60 μg范围内,黄芩苷进样量在0.52～6.18 μg范围内,连翘苷进样量在0.20～2.04 μg范围内,汉黄芩素进样量在0.13～1.76 μg范围内,线性关系良好。

　　2.4  精密度试验

   　 精密吸取绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素混合对照品溶液注入液相色谱仪,连续进样5次,绿原酸峰面积RSD＝1.12%,黄芩苷峰面积RSD＝0.86%,连翘苷峰面积RSD＝0.72%,汉黄芩素峰面积RSD＝0.58%。结果表明,所选方法精密度良好。

　　2.5  稳定性试验

    　精密吸取同一供试品溶液,分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样,测定样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷和汉黄芩素的峰面积,结果绿原酸RSD＝1.74%,黄芩苷RSD＝2.04%,连翘苷RSD＝1.81%,汉黄芩素RSD＝2.38%,表明样品溶液在24 h内稳定。