六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响
2.4 大鼠前脂肪细胞生长曲线
按文献[3]方法测定,从生长曲线可见前脂肪细胞的倍增时间约为60 h。
2.5 酶组织化学提取法测定大鼠前脂肪细胞分化过程中的标志物――甘油磷酸脱氢酶(GPDH)动态变化
根据文献[4]的方法进行测定。结果传代细胞形成单层汇合后,在胰岛素10 μmol/L和地塞米松1 μmol/L的作用下即开始上升并迅速增加,10 d左右到达高峰并维持在高水平。形态上表现为单层汇合1周后,细胞内出现大量脂滴。
2.6 油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量
用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2 h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490 nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6 d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。
2.7 分组及给药
将第4代的大鼠前脂肪细胞接种到96孔板,贴壁后于96孔培养板每6孔一组,分为4组：10%空白大鼠血清组,六味地黄丸药物血清高、中、低剂量组(浓度分别为10%、5%、2.5%,简称高、中、低剂量组)。上述各组所含血清的终浓度均为10%,血清含量不足者以空白大鼠血清补齐。
2.8 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响
配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10 000个/孔接入96孔培养板中,37 ℃、5% C02培养12 h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h。将浓度为5 g/L MTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4 h,吸干培养液,每孔加100 μL DMSO,混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。
2.9 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响
配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10 μmol/L＋地塞米松1 μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30 000个/孔接种于96孔培养板中,37 ℃、5% CO2培养5 d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5 d。培养结束后, 酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。结果见表1。
2.10 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响
培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37 ℃、5% CO2培养10 d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5 d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1 h,用油红0工作液(2 g/L)染色2 h,用双蒸水充分洗净,培养板放入37 ℃温箱使残余水分蒸发,用异丙醇溶解细胞内油红0,置酶标仪510 nm观测吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。结果见表1。表1 六味地黄丸含药血清对大鼠前脂肪细胞增殖、GPDH、脂肪分解作用的影响(略)注：与A组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
3 讨论
能量摄入长期超过能量消耗,大多数多余能量以三酰甘油的形式储存在脂肪细胞,从而导致脂肪细胞的增生和肥大。增殖和分化是细胞发育过程中的两个不同方面,脂肪组织含有增殖、分化活跃的前脂肪细胞,它的存在和作用持久,与肥胖及脂肪移植成活率都有密切的关系。有研究表明,其分化异常可导致一系列代谢性疾病发生[2]。实验发现,六味地黄丸可抑制大鼠前脂肪细胞的分化,促进大鼠前脂肪细胞的增殖。
由于含药血清加入机体反应体系后,浓度被稀释,从而使反应体系药物浓度达不到在体条件下的药物浓度,有人认为给药剂量应以整体模型动物的有效剂量(即临床成人剂量的8～18倍量)为妥[5]。由于本实验中六味地黄丸配制出的最大灌胃药液剂量大约为临床成人剂量的12倍,故实验时选择了12倍临床剂量的给药量。
有研究认为,在采用血清药理学方法进行研究时,应考虑血清本身所含物质及血清体积等因素对体外实验结果的影响,中药复方血清药理实验中体外培养液中的含药血清浓度,应以临床等效剂量为基准,以10%较为合适,一般不超过培养液的20%,过高或过低都不宜[5]。故本实验所取复方药物血清浓度在10%以内。
本实验研究表明,大鼠前脂肪细胞经传代培养后,进入对数生长期时间约为60 h；GPDH作为前脂肪细胞分化的标志性酶,在传代细胞形成单层汇合后,在10 μmol/L胰岛素和1 μmol/L地塞米松的作用下即开始上升并迅速增加,10 d到达高峰并维持在高水平；前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,故本实验选择在大鼠前脂肪细胞生长稳定后的第48小时加入各含药培养液，以观察其对大鼠前脂肪细胞增殖的影响；在大鼠前脂肪细胞促分化生长的第5天加入各含药培养液,以观察其对大鼠前脂肪细胞分化过程中GPDH的影响。在大鼠前脂肪细胞促分化生长的第10天加入各含药培养液以观察其对大鼠前脂肪细胞分化过程中脂肪积聚的影响。但六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖、分化过程中的各个阶段有何影响,其作用的确切机理为何,尚有待于深入研究。
【参考文献】
[1] 王秋娟.六味地黄煎剂研究Ⅰ：全丸及拆丸对小鼠耐缺氧与降血脂的作用[J].中国药科大学学报,1990,21(4)：241.
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[3] 马瑾瑜,顾映红,余竹元.用快速比色计量法测定细胞生长[J].上海医科大学学报,1993,20：309－311.
[4] Stuart J,Simpson JS.Dehydrogenase enzyme cytochemistry of unfixed leucocytes[J].J Clin Path,1970,23：517－521.
[5] 李振光,王净净.关于中药血清药理学方法的思考[J].中国中医药信息杂志,2002,9(2)：5－6.