六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响
作者：肖子曾,戴冰,刘磊,冷旺,邹双华
【摘要】 目的 探讨六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖与分化的影响。方法 原代培养大鼠前脂肪细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测六味地黄丸含药血清对前脂肪细胞的增殖情况,以酶组织化学法检测其对前脂肪细胞分化过程中的磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的影响,油红O染色方法测定其对细胞内脂肪积聚的影响。结果 10%以内六味地黄丸含药血清对大鼠前脂肪细胞的增殖有促进作用,对分化过程中的GPDH升高有抑制作用,而对于分化过程中的脂肪积聚则有促进分解的作用。结论 六味地黄丸能促进大鼠前脂肪细胞的增殖,抑制大鼠前脂肪细胞的分化。
【关键词】 六味地黄丸；大鼠；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化
Abstract：Objective To investigate the influence of Liuwei Dihuang pills on proliferation and differentiation of rat preadipocytes. Methods Rat preadipocytes were cultured, the influence of Liuwei Dihuang drug-containing serum on proliferation of rat preadipocytes was detected by MTT method, the influence of Liuwei Dihuang drug-containing serum on expression of GPDH was determined by enzyme tissue chemical method, the effect on lipid accumulation was determined by Oil Red O staining. Results Liuwei Dihuang drug-containing serum stimulated rat preadipocyte proliferation, inhibited GPDH up-regulation during differentiation, inhibited lipid accumulation in cell differentiation with the concentration below 10%. Conclusion Liuwei Dihuang pills stimulated rat preadipocyte proliferation, inhibited rat preadipocyte differentiation.
Key words：Liuwei Dihuang pills；rat；preadipocytes；cell proliferation；cell differentiation
研究表明,口服六味地黄汤能明显降低实验性高血脂大鼠总胆固醇和肝中脂肪含量[1],提示其对脂肪细胞的增殖、分化可能有一定影响。现已有报道,肥胖是引发上述疾病的重要因素[2]。从细胞水平看,肥胖是由于前脂肪细胞的不断分化所致的脂肪细胞数目增多及体积增大引起。脂肪细胞的分化将影响糖脂代谢,进而影响代谢性疾病的发生发展。为观察六味地黄丸对脂肪细胞的增殖、分化究竟有无影响,我们进行了以下实验研究,现报道如下。
1 实验材料
1.1 药物及试剂
六味地黄丸(长沙九芝堂,批号20050361)；地塞米松(批号123K06612),胰岛素(批号024K1188),含酚红DMEM低糖培养基(批号123K83031),磷酸二羟丙酮(批号027K1635),上述试剂均购自Sigma公司；MTT(批号1313Bl1)购自Amresco公司；标准胎牛血清(批号20050617)购自兰州民海生物工程有限公司；油红0(批号830120)购自北京夏新试剂分装厂。DMSO购自宜兴市化工厂；水为双蒸水；其余试剂均为分析纯。
1.2 动物
健康Wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重(200±20)g,湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:医动字第0-002号。
2 方法与结果
2.1 六味地黄丸药液的制备
取六味地黄丸200丸(每8丸相当于原药材量3 g),加纯净水约300 mL,搅拌,煮沸,使之完全溶解后,添加纯净水至375 mL,使其药液浓缩至2.0 g/mL(以原药材含量计),供实验用。
2.2 空白及含药血清样品制备
取Wistar大鼠, 雌雄各半,随机分为对照组(A组)和六味地黄丸高(B组)、中(C组)、低(D组)剂量组,每组30只。禁食12 h(自由饮水),按照30 g/kg(以原药材含量计)剂量(相当于临床等效剂量的12倍,临床等效剂量即为人的临床用药量换算成大鼠的等效剂量),分别灌胃给予蒸馏水和六味地黄丸给药样品溶液,1%戊巴比妥钠麻醉,经肝门静脉取血5 mL,离心血液,取上清液过0.22 μm微孔滤膜后用于实验。
2.3 大鼠前脂肪细胞的培养
取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒,pH 7.2缓冲生理盐水(PBS)洗涤,剪成0.5～l mm3大小均匀的小颗粒,以1 000 r/min离心10 min,取上层的纯脂肪颗粒轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37 ℃、5% C02培养1～2 h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。