金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究
作者：潘曌曌,王雪峰,闫丽娟,南春红,岳志军
【摘要】 目的 观察金银花提取物体外抑制甲型流感病毒FM1株的作用。方法 采用血凝试验方法,测定不同浓度金银花提取物体外和鸡胚内抑制流感病毒效价,分析金银花提取物对病毒增殖的影响。结果 与病毒对照组比较,金银花提取物组血凝效价降低,其抑制作用时间可从1 h持续到24 h,其对病毒的抑制作用随着药物浓度的降低而逐渐减弱；金银花提取物在100、50、25 mg/mL时,对感染流感病毒鸡胚具有预防和保护治疗作用(P<0.001),而在100 mg/mL时的预防作用明显优于阳性对照病毒唑组(P<0.05)。结论 金银花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株。
【关键词】 甲型流感病毒；金银花提取物；绿原酸；鸡胚
Abstract：Objective To observe the effect of extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus FM1 strain. Method Use the method of hemagglutination test, determine the hemagglutination inhibition titer that extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus in vitro and in embryonated egg. Result Compared with the control group, the hemagglutination inhibition titer of extracts from Flos Lonicerae group were degraded. The depressant effect kept on from 1 hour to 24 hour, and the depressant effect were degraded with the stepping down of the concentration. At the concentration of 100, 50, 25 mg/mL, extracts from Flos Lonicerae had the preventative effect and therapeutical effect on embryonated egg infected by influenza A virus (P<0.001). At the concentration of 100 mg/mL, the preventative effect of extracts from Flos Lonicerae group was better than Ribavirin group (P<0.05). Conclusion Extracts from Flos Lonicerae can suppress influenza A virus FM1 strain actively.
Key words：influenza A virus；extracts from Flos Lonicerae；Chlorogenic Acid；embryonated egg
本实验对金银花体外抗流感病毒作用进行系列研究,旨在阐明该药在中药复方银翘散中抗流感病毒作用的物质基础,为将该药及其有关复方研制成治疗病毒性呼吸道疾病的现代(复方)中药奠定基础。
1 实验材料
1.1 药物及主要试剂
金银花饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局,经辽宁中医药大学中药分析教研室张振秋教授鉴定为忍冬科植物忍冬的花蕾金银花。利巴韦林注射液(江苏吴中实业股份有限公司,批号060208)；绿原酸对照品(自配,浓度0.111 2 mg/mL)。
1.2 病毒
甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1),中国预防医学科学院病毒研究所提供,冻存于辽宁中医药大学病毒室,经鼠肺、鸡胚传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。
1.3 鸡胚
9日龄尼克白种鸡胚,SPF级,购于辽宁省益康生物制品厂。
1.4 1%鸡红细胞悬液
采集健康公鸡血,阿氏液抗凝,生理盐水1 500 r/min离心洗涤3次,弃上清,以无菌生理盐水配制成1%悬液,4 ℃冷藏备用[1]。
1.5 主要仪器
Ⅱ级生物安全柜(美国Baker公司,型号：SG403TXCE)；高效液相色谱仪(日本岛津SPD-10AVP)；N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工作研究所)；低温高速离心机(德国Heraeus,型号：Biofuge 28RS)；台式压力蒸汽灭菌器(沈阳盛达生物电子设备有限公司)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；AS3120电子超声仪。
2 实验方法
2.1 金银花提取物的制备及其鉴定
2.1.1 药物提取
电子天平称量金银花饮片放入圆底烧瓶中,加入配制好的80%乙醇14倍量,电热套加热回流2 h；第1次提取后倾倒滤液,药渣再加80%乙醇10倍量,加热回流1 h；合并滤液,加热浓缩,水浴箱通风橱加热挥发成膏状,置于电热烘箱内烘干,研成粉末避光冷藏备用。用于体外实验时,用生理盐水配成浓度为400 mg/mL的溶液,高速离心机4 000 r/min离心30 min,取上清,高温高压灭菌后4 ℃冷藏备用。
2.1.2 供试品溶液的制备
精称样品粉末0.1751 g,置锥形瓶中,加50%甲醇50 mL定容,超声30 min；放冷,过滤,取续滤液5 mL,入棕色量瓶保存待测,检测时用0.45 μm微孔滤膜过滤。
2.1.3 标准曲线绘制及样品的测定
吸取对照品溶液5 μL注入液相色谱仪,以乙腈-0.4%磷酸(13∶87)为流动相,柱温为35 ℃；流速为1.0 mL/min,于327 nm波长处检测；以绿原酸峰面积为纵坐标,绿原酸量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程。并在上述色谱条件下测定对照品溶液及供试品溶液的峰面积。