何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化
3.2 何首乌RAPD-PCR反应体系的正交优化
如图3，按照表2依次加入反应体系后，使用引物OPZ-18，模板为广西靖西何首乌基因组DNA。参照谢运海等［7］ 的方法，根据谱带强弱和条数，对RAPD-PCR扩增结果进行直观分析。在图3中可以直观的看出，16个不同组合中扩增存在着明显的差异，有些组合甚至没有条带出现，12，15条带虽然亮度较强，且多态性好，但是有明显的弥散现象，应该是Tag酶过多的原因。10，13，14，16号孔均条带较暗且多态性不好，1，2，3，7条带虽然较亮，但是多态性不好。5，12号孔扩增效果较好，谱带清晰，多态性好，然而背景有一些弥散。 4号孔扩增效果最好，条带清晰，多态性好。
4 讨论
对于植物新鲜组织DNA的提取，已有比较成熟和可行的方法［8, 9］ 。然而，对于中药材，其药用部位大都是老组织或是已经没有生命力的组织，其中沉积的次生代谢物很多，例如多糖，酚类等物质，这些都影响到基因组DNA的提取和质量。由于使用的是何首乌块根，里面的各种次生代谢物很多，主要是一些多糖难以去除，且容易与DNA形成复合物。不仅影响基因组DNA的质量，而且其是否会对RAPD扩增产生影响也是亟待解决的。研究后发现，通过改良后的CTAB法提取何首乌基因组，其浓度和质量已经符合实验的要求。在对其进行RAPD预扩增时也证明了该方法提取的基因组DNA用于RAPD分析的可行性。
RAPD反应体系的优劣主要通过谱带的强弱和条数来确定的。本实验采用正交设计方法，实验结果也是通过直接观察判别，而不用进行定量分析。传统优化实验中镁离子、dNTP、引物都有一个有效扩增浓度范围，低于或高于此浓度则不能进行有效扩增。然而正交实验设计后，Tag酶，引物，镁离子，dNTP，模板5个因素各个水平在不同有效扩增中均有出现，也说明了RAPD-PCR能否有效扩增的各组分浓度其实也是一个相对的动态过程。
Tag酶浓度也不宜过高，否则容易引起非特异性扩增和加深背景。引物也是如此，过高的引物浓度易引起错误引导，并使背景加深，降低遗传多样性分析统计的可靠性。图3中，8，11，13号孔均没有条带出现，说明没有有效扩增，主要是因为dNTP浓度过高，达到500 μmol/L，而镁离子的浓度却没有增加到一定的浓度，使体系中游离的镁离子浓度降低，降低酶的活性。2号孔条带较清晰，dNTP浓度同样是500 μmol/L，但是镁离子浓度也同样达到了4 mmol/L，所以可以有效扩增。然而，体系中，各组分的浓度也不能过高，2，5，12，15号孔背景有一点弥散，主要是由于镁离子浓度过高引起。当然，镁离子浓度也不能过低，3，6，9，14号孔镁离子浓度为1 mmol/L，虽然有些可以有效扩增，但是由于Tag酶活性得不到很好的激活，产物产量低，条带暗淡。RAPD对于模板的要求并不是特别高，反应中DNA模板适应的浓度较大，高浓度的模板对RAPD扩增影响不大，这个与传统的优化方法一致。总之，通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA，得到了适合RAPD分析的基因组DNA提取方法，并通过正交实验得到多个有效的扩增组合，避免了传统优化方法经常出现的繁琐和不稳定的现象，并且体现了各个影响因素的动态交互作用，可以根据成本和实际的需求选择一个最佳的组合。
【参考文献】
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