六月青石油醚萃取物体外对胃癌细胞SGC-7901 凋亡的影响及其作用机制研究

　　4讨论

　　胃癌的发病率高并且难治，目前以手术、放疗和化疗为主要治疗手段。研究证实胃癌患者在接受放化疗手术后，如能给予药物辅助治疗将对改善患者生活质量和提高生存率具有重要意义[4]。

　　从中药中寻找抗肿瘤有效成分具有广阔的前景，已经引起国内外许多学者的关注。六月青在广西分布广泛，一些初步的试验证实其有一定的抗肿瘤活性，本实验室前期动物试验结果表明LYQPE能抑制S180荷瘤小鼠移植性肿瘤，本研究中所选胃癌细胞，SGC-7901是常用于研究的中分化胃癌细胞株。细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，即有核细胞在一定条件下启动自身的内部机制使得内源性DNA内切酶激活而引起的细胞死亡过程，即受基因、信使调控的单个细胞自杀过程[5]。凋亡早期形态学改变为：① 细胞皱缩胞浆凝缩，细胞器互相靠近。② 核的致密化是凋亡细胞最重要的形态特点，此时见到核染色质浓聚、固缩，沿着核膜排列，形成不同的形状(如新月状或环状)聚集在核膜周边，然后染色质逐步分裂成碎片。③ 细胞器浓缩，细胞膜下陷，包裹核碎片和细胞器，形成凋亡小体[6]。随肿瘤分子生物学研究的深入，人们已发现愈来愈多的化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡[7,8]，诱导凋亡将是筛选抗肿瘤药物的重要研究方向，也是评价药物疗效的可靠指标。磷脂酰丝氨酸外翻分析法(Annexin V-PI)[9]将Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。本实验利用磷脂酰丝氨酸外翻分析法所得结果显示，LYQPE能明显促进SGC-7901凋亡，在大剂量主要是导致SGC-7901直接坏死。

　　p53基因是影响凋亡过程[10]的重要分子事件，正常存在于细胞内的p53 基因为野生型, 诱导细胞凋亡与其DNA结合功能及基因调控功能有关，对肿瘤细胞增殖起抑制作用[11]。野生型p53在细胞生长过程中，以一种“分子警察”(molecular police) 的身份监控细胞内DNA 状态，p53基因产物参与G1-S和G2-M检查点而对细胞周期调控，如果细胞DNA受损，p53表达增加可诱发细胞周期停止，以利DNA修复，而一旦修复失败，p53蛋白可持续增高，野生型p53 蛋白产物可作为凋亡的强诱导物诱导受损细胞和瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的发生和生长。p53缺乏时，Bcl-2蛋白增高，Bax蛋白表达降低，可使细胞凋亡明显受抑，导致突变细胞扩展。而当p53基因发生突变时，突变型p53能与野生型p53亚单位结合形成寡聚体干扰其功能，可致细胞过度增殖，失去其正常的抑癌功能，细胞凋亡受抑。Hiao等[12]用免疫组化CM-1单抗发现60%的胃癌中有p53基因的表达异常。因此，可通过诱导野生型p53表达或抑制突变型p53表达来促进肿瘤细胞凋亡[13]。SGC-7901为p53突变型胃癌细胞株[14]，本实验结果显示，LYQPE能够在蛋白和mRNA水平抑制突变型p53的表达，从而体细胞进入正常的凋亡途径。

　　CD44是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，属于表面黏附因子， CD44的高水平表达与肿瘤的转移和浸润密切相关已被大多数研究所证实[15～18]。CD44基因的外显子按剪接方式的不同分为标准(CD44s)及变异型(CD44v)，而变异型按外显子拼接类型不同又分为许多亚型，其拼接变异体主要表达在上皮源型细胞和肿瘤组织中[19]。变异型CD44作为一种透明质酸的受体，分子的NH2末端功能区能链接细胞外间质受基底膜的透明质酸盐调节细胞的运动和形态，同时“锚”定在宿主细胞外间质及基底膜上，CD44v6阳性细胞更易与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，使肿瘤细胞更易进入淋巴系统和循环系统，同时透明质酸降解产物还能启动血管的发生，为侵袭转移奠定基础CD44v6分子在人类胃癌组织中的阳性表达率为64%~77%，其阳性表达与胃癌的进展程度有关[20]。孙喜文等[21]发现，胃癌原发灶CD44v6阳性表达率为62%。周世庆等[22]发现，人胃癌细胞株SGC-7901细胞中CD44v6阳性表达率为69.4%，与国内外报道基本一致。本试验结果显示，LYQPE能够降低SGC-7901的CD44 mRNA水平的表达使其蛋白表达减少，从而使细胞脱壁、漂浮、停止生长，进而导致其凋亡，死亡。

　　细胞凋亡时超微结构呈现典型改变，如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，这些特征为透射电子显微镜下判定细胞凋亡提供了最直观、最可靠的依据。我们的电镜结果从细胞超微结构水平验证了LYQPE对SGC-7901的抑制作用和促凋亡作用。

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