六月青石油醚萃取物体外对胃癌细胞SGC-7901 凋亡的影响及其作用机制研究

                     作者：张志伟，黄仁彬，王乃平

【摘要】  目的研究六月青石油醚萃取物(petroleum ether extract of LYQ，LYQPE)对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。方法用不同浓度的LYQPE作用于SGC-7901，作用48 h后，流式细胞术检测对细胞凋亡及其凋亡相关蛋白p53影响;RT-PCR检测凋亡相关基因p53 mRNA和黏附基因CD44 mRNA的变化;电镜观察超微结构变化。结果LYQPE体外作用于SGC-7901，在40~320 μg/ml时呈不同程度的促进凋亡;呈剂量依赖性的抑制p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达;在160μg/ml时，电镜观察可见典型的凋亡形态学改变。结论LYQPE对SGC-7901有明显促凋亡作用;LYQPE抑制SGC-7901 p53蛋白、mRNA水平和CD44 mRNA水平的表达有可能是促进SGC-7901凋亡的作用机制。

【关键词】  六月青石油醚萃取物;SGC-7901;流式细胞术;细胞凋亡;RT-PCR;电镜

　胃癌是我国最常见的肿瘤之一，其死亡人数在我国居恶性肿瘤的首位[1]。手术对早期胃癌有较好的疗效，但对中晚期的胃癌疗效欠佳。因此寻找疗效好、副作用小的治疗方法仍是目前肿瘤研究的焦点之一。六月青系爵床科植物肖鸡笼的干燥地上部分，是一种广西民间草药。《本草拾遗》记载，其能活血、凉血、舒肝泻湿、消肿止痛，主要用于急慢性肝炎、黄疸等[2]。中医学理论中肝克脾，胃为脾之腑，胃与脾相表里，说明肝与胃是有中医理论功能联系的。前期实验对六月青各化学部位进行了初步筛选，结果表明六月青石油醚部位体外对胃腺癌细胞系SGC-7901和MKN-45有明显的抑制作用。关于六月青的研究资料报道中，石油醚部位能显著增加小鼠胸腺重量和小鼠血清溶菌酶的含量[3]，表明六月青石油醚萃取物有一定的增强免疫作用。本实验室用醇提石油醚萃取的方法得LYQPE，经初步的实验，有较好的抗瘤效果，且未发现明显的毒副作用。本实验旨在研究六月青石油醚萃取物对人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其部分作用机制。

　　1材料与仪器

　　1.1细胞SGC-7901胃癌细胞株由第四军医大学试验动物中心提供，由本实验室自行传代培养。细胞常规培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃ 5% CO2及饱和湿度下培养，隔天换液，待细胞生长80%～90%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。

　　1.2药物六月青，采于广西灵山县，经广西中医药研究所鉴定，其地上部分粗粉用85%乙醇回流提取，过滤得滤液经旋转蒸发回收乙醇，浓缩液用溶剂石油醚萃取，萃取液经旋转蒸发回收石油醚后收集，恒温箱烘干得LYQPE备用;5-FU，上海旭东海普药厂，批号：061006; LYQPE用含10%DMSO的RPMI-1640溶液配制成浓度分别为6.4，3.2，1.6，0.8 mg/ml的溶液各5 ml，备用。5-FU作为阳性药用含10% DMSO的RPMI-1640溶液配制成2 mg/ml的溶液5 ml，备用。

　　1.3试剂Annex V凋亡试剂盒，Biovision公司;p53检测试剂盒，BD Bioscience公司;RPMI-1640培养液，购自美国Gibco公司; PBS，美国Gibco公司;胰蛋白酶，美国Amersco公司;Trizol，美国Invitrigen公司;First strand cDNA synthesis kit，美国MBI;DEPC美国Sigma公司;2×PCR TaqMix，Takara公司;PCR扩增引物，北京三博远志公司;戊二醛，美国Sigma公司。

　　1.4仪器PTC 200多通道PCR扩增仪，美国MJ公司生产;Epics XL流式细胞仪，美国Beckmon - Coulter公司生产。

　　2方法

　　2.1细胞凋亡的流式细胞术检测取对数生长期SGC-7901 1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48h，0.25%胰酶消化，PBS冲洗2次，用100 μl 含钙离子buffer重悬，加5 μl Annex V-FITC染料染色20～30 min，加5 μl PI燃料染色5 min，加入适量含钙离子buffer调整细胞浓度到1×105个/ml左右，上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，发射波长530 nm。

　　2.2流式细胞仪检测p53蛋白取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，0.25%胰酶消化，PBS冲洗2次，加入1%多聚甲醛100μl固定15 min，3 ml PBS洗1次，加入0.1% saponin 100 μl破膜5~10 min，分成两管，分别加入10 μl IgG-FITC和p53-FITC，染色15 min，3 ml PBS洗1次，加入0.5～1.0ml PBS上机检测。激发波长为488 nm，发射波长530 nm。

　　2.3p53和CD44RT-PCR检测取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度分别为40，80，160，320 μg/ml，5-FU 100 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，细胞总RNA的提取参照Trizol试剂盒说明书进行。逆转录反应后，加入下列引物进行PCR扩增：p53(117 bp)上游5'-TTTGGGTCTTTGAACCCTTG-3'，下游5'-CCACAACAAAACACCAGTGC-3';CD44(134 bp)上游5'-CCAGCTAAGGACATTTCC CA-3'，下游5'-ACTAGTACACCCCAACCCCC-3';同时以GAPDH (452 bp)上游5'-ACCACAG TCCATGCCATCACT-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'作为反应内参照.扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶图像分析仪检测p53和CD44与GAPDH扩增片段灰度的比值。

　　2.4超微结构的电镜观察取对数生长期SGC-7901细胞1×105培养于50 ml培养瓶中24 h，LYQPE 设终浓度为160 μg/ml和空白对照组。共同培养48 h，0.25%胰酶消化，离心，2%戊二醛固定，送电镜室制备标本，照相。

　　2.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件，量的数据均以±s表示，比较采用t检验，率的比较采用卡方检验。

　　3结果

　　3.1LYQPE对SGC-7901细胞凋亡的影响与对照组相比，40~320 μg/ml LYQPE不同程度的促进SGC-7901凋亡，但有一个明显的规律是随着LYQPE计量的增加，正常细胞的比例逐渐下降，在80 μg/ml LYQPE以促进SGC-7901凋亡为主(28.2%)，在320 μg/ml LYQPE以促进SGC-7901坏死为主(24.6%)。结果见表1。表1LYQPE作用48h，流式细胞术检测SGC-7901坏死、　　正常和凋亡细胞比例变化

　　3.2LYQPE对SGC-7901 p53的影响

　　3.2.1p53蛋白表达的流式细胞术检测与空白对照组(55.4%)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的p53蛋白表达，随着剂量增加，p53蛋白阳性表达细胞分别为：23.40%**，17.70%**，12.80%**和8.81%**(**P<0.01)。结果见图1。图1LYQPE作用48 h对SGC-7901 p53蛋白表达的影响

　　3.2.2p53 mRNA表达的RT-PCR检测p53与GAPDH mRNA的比值( ±s, n=3)，与空白对照组(0.767±0.028)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的p53 mRNA表达，随着剂量增加，p53 mRNA相对表达量分别为： 0.657±0.022、0.645±0.016**、0.571±0.026**和0.555 0.021**(**P<0.01)，结果见图2。

　　3.3CD44 mRNA表达的RT-PCR检测CD44与GAPDH mRNA的比值(±s, n=3)，与空白对照组(0.417±0.029)相比，40~320 μg/ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制SGC-7901的CD44 mRNA表达，随着剂量增加，CD44 mRNA相对表达量分别为：0.430±0.019，0.342±0.019*，0.253±0.018**和0.152±0.022**(**P<0.01)。结果见图3。

　　3.4SGC-7901超微结构变化的电镜观察A1、A2和A3为正常SGC-7901细胞，可见细胞膜、核膜完整，胞核大，核质均匀，核仁明显，细胞微绒毛，即指状突起，胞浆核糖体丰富。A4、A5和A6为LYQPE作用后的SGC-7901，可见胞质内大量空泡，胞核变形，核碎裂，胞核消失，全胞深染，细胞器消失。结果见图4。M：marker;P：5-FU 100 μg/ml;C：空白对照组;L、I、H和VH：依次为LYQPE 40，80，160和320 μg/ml图2LYQPE作用48h，RT-PCR检测SGC-7901p53的mRNA表达量的变化M：marker;P：5-FU 100μg/ml;C：空白对照组;L、I、H和VH：依次为LYQPE 40、80、160和320 μg/ml图3LYQPE作用48 h，RT-PCR检测SGC-7901 CD44的mRNA表达量的变化A1~A3：为正常SGC-7-901细胞，A4~A6：为ZYQPE作用后SGC-7-901细胞图4LYQPE作用48 h，透射电镜观察，SGC-7-901超微结构变化