维药罗勒提取物对脂多糖诱导RAW264.7细胞环氧化酶-2酶活性的影响

                 作者：何志琴，艾尼瓦尔·吾买尔，阿布力孜

       阿布杜拉，田树革，加米拉·托乎提，周文婷，依巴代提·吐乎提

【摘要】  　　目的探讨维药罗勒不同提取部位在体外对COX-2酶活性的影响，进而找出该药的抗炎作用机制及有效部位群。方法MTT法筛选维药罗勒不同提取部位的细胞给药浓度，并对脂多糖诱导的RAW264.7细胞进行不同时间的药物干预，用ELISA法检测细胞上清液中PGE2的含量。结果各部位在不同时间内均对PGE2有抑制作用，其中醋酸乙酯及正丁醇部位对PGE2有较大的抑制作用。结论维药罗勒可通过直接抑制COX-2的酶活性产生抗炎作用，醋酸乙酯及正丁醇部位是该药的有效部位群。

【关键词】  罗勒； 环氧化酶； 抗炎； 有效部位群

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of Uighur Ocimum basilicum L. on COX-2 enzyme activity in LPS-induced RAW264.7 cells , and find its anti-inflammatory mechanism and effective parts. MethodsMTT method was used to the eligible concentration of different polar extracts of Uighur Ocimum basilicum L. . After RAW264.7 were interfered with 2 mg·L-1 LPS for 8 h , and then different polar extracts of Uighur Ocimum basilicum L. for 30 min , the concentration of PGE2 in supernatant was analyzed by ELISA . After RAW264.7 cells were pretreated with different polar extracts of Uighur Ocimum basilicum L. for 30 min , and then 2 mg·L-1 LPS for 24 h , the concentration of PGE2 in supernatant was analyzed by ELISA . ResultsThe concentration of PGE2  was inhibited by different polar extract of Uighur Ocimum basilicum L. . The inhibition ratio by acetidin part and n-butanol part were higher .ConclusionThe anti-inflammatory activity of Uighur Ocimum basilicum L. was related to inhititing the activity of COX-2 enzyme, and the effective parts are acetidin part and n-butanol part .

　　Key words： Ocimum basilicum L.;   Cyclooxygenase-2;  Anti-inflammatory activity;  Effective parts
   
　　罗勒Ocimum basilicum L．是唇形科罗勒属植物，是维吾尔医应用历史悠久的常用药材之一，有抗炎、抗氧化、降血脂、祛痰等作用［1］。江国华等［2］的研究表明，罗勒的抗炎机制与其抑制前列腺素(PGE2)生物合成有关。PGE2是一种与炎症紧密相关的重要介质，环氧化酶-2(COX-2)为PGE2生物合成的重要限速酶，在遇到外界刺激如脂多糖(LPS)、致癌基因等时可在巨噬细胞、滑膜细胞、内皮细胞等中高表达。许多非甾体抗炎药就是通过抑制COX-2的酶活性或酶蛋白表达，降低其催化产物PGE2的生物合成来达到抗炎镇痛的疗效。本文探讨了维药罗勒对脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7细胞COX-2酶活性的影响，进一步研究维药罗勒抑制PGE2生物合成的机制。目前对维药罗勒药理作用的研究主要采用的是提取物，研究表明其乙醇提取物往往有更好的效果，所以本文进一步对维药罗勒的乙醇总提取物及4个不同萃取部位进行研究，筛选出该药的有效部位群。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂DMEM干粉(Gibco)，胎牛血清FBS(杭州四季青)，双抗(Sigma)，MTT(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，DMSO(Sigma)，ELISA试剂盒(武汉中美科技有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2  药物制备将从新疆吐鲁番采集的罗勒全草阴干后，剪碎，称取适量药材，用70%乙醇室温密闭浸泡1 h后超声30 min，提取3次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇得提取物，取部分提取物加适量水分散后，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，包括母液共得到5个不同极性的提取部位，用OBL-乙醇总提取物、OBL-石油醚，OBL-氯仿，OBL-醋酸乙酯，OBL-正丁醇表示，分别减压浓缩回收各部位溶剂，挥干溶剂后，进行冷冻干燥。实验时，用二甲基亚砜(DMSO)溶解干燥物，15 000 r/min离心10 min，取上清，热压灭菌后，-20 ℃保存备用，实验前用DMEM培养基稀释成所需浓度。

　　1.3  细胞培养小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7细胞购自武汉大学细胞库(中国典型培养物保藏中心CCTCC)，在37℃，5% CO2条件下，用含10% FBS、1%双抗的DMEM培养基传代培养［3］，实验用细胞均处于指数生长期。

　　1.4  维药罗勒5个提取部位的给药浓度的筛选用含10%FBS的DMEM培养基将OBL-乙醇总提取物、OBL-石油醚，OBL-氯仿，OBL-醋酸乙酯，OBL-正丁醇溶液分别稀释成196.50，114.5，396，650，359μg·ml-1，每种药物再分别以2倍进行4次倍比稀释，得到5种不同浓度梯度的药物。
   
　　取对数生长期的RAW264.7细胞，消化离心后，用含10%FBS的DMEM培养基稀释成浓度为1×105个·ml-1，以每孔200μl接种到96孔培养板中，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，吸弃孔内液体，分别以每孔200μl加入配制好的5种不同浓度的药物，设置1% DMSO溶媒对照组及正常对照组，每组设3复孔，置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，吸弃孔内液体，用PBS洗1次，换成每孔180μl的无血清培养基，每孔加入20μl  5 mg·ml-1的MTT溶液，37℃避光温育4 h，吸弃孔内液体，每孔加入150 μl DMSO，490 nm波长下测其OD值，计算细胞抑制率，确定各药的半数抑制浓度(IC50)。

　　1.5  维药罗勒5个提取部位的不同时间细胞药物干预对COX-2酶活性的影响

　　1.5.1  短时间干预对COX-2酶活性的影响参照文献［4］，略改动。将指数生长期的RAW264.7细胞按1×105个·ml-1接种于96孔培养板中，每孔200 μl，设溶剂DMSO对照组、LPS处理组、阳性药物吲哚美辛对照组及不同浓度的各部位药处理组，每组3复孔，于37℃，5% CO2培养24 h。更换培养基后，加入LPS(终质量浓度为2 mg·L-1)培养8 h (溶剂DMSO对照组不加LPS)，弃去旧培养基，用新鲜培养基洗涤两次，分别加入各组药物(溶剂DMSO对照组和LPS处理组加入0.5% DMSO)，孵育30 min，加入底物AA(终浓度为10 μmol·L-1)，37℃孵育30 min，收集细胞上清液，-20℃冻存待测。用MTT法检测活细胞数目，ELISA法测定上清液中PGE2浓度。

　　1.5.2  长时间干预对COX-2酶活性的影响所设组别同短时间干预对COX-2酶活性的影响，分别在RAW264.7细胞中加入各组干预药物预孵育30 min(溶剂DMSO对照组和LPS处理组加入0.5% DMSO)，再分别加入终质量浓度为2 mg·L-1的LPS(溶剂DMSO对照组除外)，继续在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h后取出，加入底物AA(终浓度为10 μmol·L-1)，37℃孵育30 min，收集细胞上清液，-20℃冻存待测。用MTT法检测活细胞数目，ELISA法测定上清液中PGE2浓度。

　　1.6  统计学处理数据用SPSS统计软件处理，所有结果用±s表示，采用方差分析和SNK两两比较，P<0.05为有统计学意义。