微生物发酵对溪黄草抑菌效果的影响
【摘要】 目的用不同菌种发酵和用纤维素酶预处理溪黄草，初步探讨发酵对溪黄草抑菌效果影响的机制，为开发廉价的食品添加剂，抑菌药物和节约药材资源提供新的研究途径。方法对溪黄草进行发酵等处理后，检测其醇提物的抑菌作用。结果微生物发酵对溪黄草抑菌效果存在一定的影响，酵母发酵能明显提高抑菌效果，与用纤维素酶处理的效果相似。结论利用合适菌种发酵提高药材有效成分的利用率是可行的。
【关键词】 发酵； 溪黄草； 抑菌效果
溪黄草系唇形科香茶菜属植物Rabdosia serra (Maxim.)Hara，由于和中药大辞典上所收录的中药溪黄草的原植物线纹香茶菜Rabdosia striatus (Benth.) Kodo外形相似而常作溪黄草入药，而且是广东药材市场上中药溪黄草的主流品种之一，用于清热利湿、凉血散瘀，治疗急性黄疸性肝炎、急性胆囊炎等［1］。
目前关于溪黄草抑菌效果方面的研究，主要考虑将溪黄草的提取物作为一种健康的食品添加剂。姚勇芳［2］研究了溪黄草中抑菌物质的最佳提取条件，并验证了溪黄草的乙醇提取物对大肠杆菌具有抑制作用，对霉菌抑制效果不明显；战宇等［3］研究了溪黄草提取物的抑菌效果；梁盛年等［4］测定了溪黄草乙醇提取物的体外抗菌活性；段志芳等［5］还证实溪黄草水提物对杨桃果实具有一定的保鲜作用。
发酵法一直是中药炮制方法之一，随着科学技术的发展，发酵法应用范围更加广泛。这种方法借助微生物的作用，改变中药原有药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症［6，7］。本研究以枯草杆菌、乳酸菌和酵母菌为发酵菌种，研究发酵后的溪黄草醇提物对细菌和霉菌生长的抑制效果，为高效提取溪黄草抑菌有效成分，大规模生产高效、低毒、广谱而经济实用的食品防腐剂、抑菌药物以及对于循环利用和处理每年药厂大量废弃的药渣提供了新的途径和方法。
1 材料
溪黄草购自梅州市温记百草堂，经嘉应学院生命科学学院廖富林教授鉴定为Rabdosia serra (Maxim.)Hara。美乐多购自梅州市太平洋商场。干酵母粉, 广东丹宝利酵母有限公司 。 枯草杆菌、JY-LZ乳酸芽孢杆菌、大肠杆菌、白葡萄球菌、黑曲霉、青霉菌保藏于嘉应学院生命科学学院实验室。纤维素酶（绿色木酶），酶活力>15μ/mg，上海伯奥生物科技有限公司。
2 方法
2.1 工艺流程溪黄草→粉碎→称取5 g→加入水或培养基→高压灭菌(121℃，20 min)→按10%接种量接种发酵菌种→于培养箱中静止10 d→提取→测定抑菌活性。
2.2 发酵
2.2.1 种子培养基枯草杆菌种子培养基：蛋白胨1%；牛肉膏0.3%；氯化钠0.15%；pH 7.0；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌20 min。
乳酸芽孢杆菌培养基：酵母膏1.0％；蛋白胨1.0％ ；葡萄糖1％；磷酸氢二钾0.05%；硫酸镁0.1%；硫酸锰0.05%；pH7.0；121℃湿热灭菌20 min。
酵母菌培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蒸馏水配制，121℃湿热灭菌30 min。
2.2.2 发酵培养基枯草杆菌发酵培养基：蛋白胨1%；葡萄糖1%；牛肉膏0.3%；氯化钠0.5%；pH7.0；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌20 min。
乳酸芽孢杆菌培养基：酵母膏1.0％；蛋白胨1.0％ ；葡萄糖2.5％；磷酸氢二钾0.05%；硫酸镁0.1%；硫酸锰0.05%；pH7.0；121℃湿热灭菌20 min。
美乐多乳酸菌培养基：雀巢脱脂奶粉2%；葡萄糖1%；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌15 min。
酵母菌培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蒸馏水配制，121℃湿热灭菌30 min。
2.2.3 种子培养将活化后的斜面枯草杆菌、乳酸芽孢杆菌分别挑取两接种环于相应的液体培养基中，接种后分别置于37℃培养箱中培养24 h。
2.2.4 发酵培养称取5 g粉碎的溪黄草于100 ml的三角瓶内，加入30 ml蒸馏水， 121℃灭菌20 min。每瓶加入种子菌液3 ml，于适宜的温度下静止培养。同时做4种对照，即有5组实验：Ⅰ：溪黄草+水+菌；Ⅱ：溪黄草+水；Ⅲ：溪黄草+培养基+菌； Ⅳ：溪黄草+培养基；Ⅴ：培养基+菌。
发酵：将枯草杆菌系列，乳酸芽孢杆菌系列，美乐多乳酸菌系列置于(36±1)℃的恒温培养箱中静置10d，干酵母菌系列于(28±1)℃的恒温培养箱中静置10 d。
2.2.5 发酵前后菌数量的检测平板计数法，3个重复。
2.3 抑菌物质的提取称取5 g的溪黄草置于3角瓶中，加入30 ml 95%的乙醇，于70℃的恒温水浴锅中水浴2 h后，滤纸过滤，取滤液，将其于同温度的水浴锅中挥干浓缩至稠膏状，再加入95%的乙醇溶解并定容至10 ml。定容后放入冰箱中保藏备用。
发酵后的4个系列4 800 r/min离心20 min，固形物按上法处理。
纤维素酶处理及抑菌物质提取：分别称取纤维素酶0.010 8 g和0.031 0 g，加入含5g溪黄草和30ml蒸馏水的三角瓶中，加入后放入55℃的恒温水浴锅中，水浴2 h后取出，滤纸过滤，滤渣按上法处理。
2.4 抑菌活性的检测指示菌种活化后用无菌生理盐水制成106～107 cfu/ml菌悬液。
取0.2 ml菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨或PDA培养基上，静置10min。
待测样品用无菌毛细吸管吸取管长的1/3后，滴于直径为5 mm的无菌滤纸片上，每个平板上贴3片，分别做两个平行。95%乙醇作对照。
将贴了滤纸片的平板放入恒温培养箱中，静置30 min后倒置培养，大肠杆菌和白葡萄球菌培养24 h取出，黑曲霉和青霉培养48h后取出，用游标卡尺测量其抑菌圈直径。