阴茎海绵体平滑肌细胞的鉴定分析进展

                       作者：陈世涛 吕伯东 黄晓军

　　关键词：阴茎海绵体  平滑肌细胞  鉴定
　　论文摘要：阐述体外培养阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth muscle cell，CMSC)的鉴定方法。比较不同方法对于体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞(CMSC)的鉴定分析及其特异性，优化研究勃起功能障碍（erectile dysfunction ,ED）所需要的CMSC培养模型。
　　勃起功能障碍（erectile dvsfunction，ED）是一种多因素引起的男科难治性疾病[1]，严重影响患者的整体健康和生活质量[2]。阴茎海绵体平滑肌细胞(CSMC)是组成阴茎海绵体的主要功能成分，约占整个阴茎组织成分40％～50％，是调节阴茎勃起及维持勃起的重要因素，是阴茎神经调控的主要效应器部位[3-4] ，因此关于阴茎海绵体平滑肌细胞的研究显得尤为重要， 而CSMC 的培养和鉴定是研究的基础，因此CSMC纯化鉴定在细胞水平上研究ED的机制颇为关注，本文就体外培养的CMSC鉴定分析做一综述。
　　1988年, Krall 等[5]首先运用体外培养的人CMSC研究了勃起相关的生化反应。此后，体外培养扩增CMSC成为ED基础研究的重要手段[6]，但尚缺乏对体外培养的CMSC的特异性鉴定方法。Granchi等[7]很早就发现成人海绵体平滑肌细胞的培养过程中很难避免成纤维细胞污染。目前被奉为经典的Pilatz等[8]报道中海绵体平滑肌细胞的培养纯度也仅达到25%左右。现在鉴定CMSC的方法一般有光镜、透射电镜观察、相差显微镜观察、免疫组化印记法、免疫细胞化学法等[9]。
　　1   CMSC的形态鉴定
　　在常规染色中，第2代传代培养的CMSC常规苏木精、伊红染色，显微镜下观察。苏木精伊红染色显微镜显示培养细胞胞质被染成红色，且清晰、均匀，胞核染成蓝色。另外还有一些特殊的染色方法，参照杜卓民[10]方法，标本获取、固定同常规染色法，显微镜下观察。Masson三色染色法显示培养细胞胞质被染成红色。VG染色显示培养细胞胞质被染成黄色，传代培养的细胞Masson三色染色法及VG染色细胞纯度在98％以上[9]。显微镜做形态观察时，观察传代细胞培养至第2或第3代，培养细胞制成超薄切片，透射电镜下观察细胞形态，观察培养的细胞呈长梭状、放射状生长、成束的细胞平行排列。部分区域呈多层重叠，部分呈单层。呈现平滑肌细胞典型的峰—谷状生长。可观察到胞内染色质分布均匀，核仁清晰，胞内含有丰富的肌丝。使用相差显微镜时，可见培养细胞呈长梭型、放射状生长，成束的细胞平行排列。部分区域细胞多层重叠，部分区域呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的峰-谷状生长[9]。
　　关于形态学的鉴定方面，Lee等[11]认为显微镜下可以区分纺锤形的CMSC 和扁平状的成纤维细胞 ，在荧光微镜下观察到α- 平滑肌肌动蛋白（α-actin）和肌球蛋白(myosin)阳性的细胞形态不一，可呈现长梭形、纺锤形及多角形等，因此单纯从形态学区别CMSC和成纤维细胞并不可靠。
　　2   CMSC的免疫组化鉴定
　　2.1 免疫组化染色  
　　平滑肌细胞的鉴定主要依靠细胞形态及α-平滑肌肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)、结蛋白(desmin)检测[12]。
　　2.2 平滑肌细胞形态荧光显微镜鉴定  
　　培养的平滑肌细胞经α-actin单克隆抗体免疫组织化学染色,镜下可见梭形平滑肌细胞，淡蓝色胞核及浅黄色胞质，而胞浆为淡红色，并可见细胞内染成深黄色的肌动蛋白。海绵体SMC经血管内皮因子(F8 ) 染色呈阴性，细胞核及胞浆均表现为蓝色，对照的血管平滑肌细胞经 F8 :染色呈阳性，细胞核表现为蓝色、而胞浆为淡红色。以上可以鉴定培养的细胞为CMSC [9、13]。
　　2.3 α- 平滑肌肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)、结蛋白(desmin)的鉴定 
　　肌动蛋白是一种具有收缩能力的微丝蛋白在真核细胞中普遍存在，含量丰富，依其氨基酸序列和构型的不同而有不同的类型，至少存在6种亚类，其中两种广泛存在于肌肉与非肌肉细胞的胞浆中，称为β和γ肌动蛋白 另外4种主要分布于肌细胞中，统称为α-actin ，按分布的不同 ,又分为横纹肌的α-S-actin ,心肌的α-C-actin ,血管平滑肌的α-SM-actin,胃肠道平滑肌的α-γ-actin四种。阴茎海绵体平滑肌细胞属于α-SM-actin。平滑肌特异性的平滑肌肌动蛋白单克隆抗体进行免疫组化染色，是鉴定CMSC的特异性标记。而myosin是粗肌丝的主要组成成分，Desmin是中间丝的主要成分，都是平滑肌细胞的良好标志 [9] 。
　　陈斌等[9]用SABC法，分别用子宫肌瘤平滑肌标本作为α-actin、myosin、desmin的阳性对照，以大动脉作为Ⅷ因子阳性对照，每次实验均以PBS代替一抗作为阴性对照。α-actin和myosin免疫组化染色显示培养的细胞、均呈现阳，而desmin及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阴性。将培养传代的细胞移入不含血清的DMEM培养基培养后，再次做结蛋白免疫组化 ，则出现抗结蛋白免疫组化染色阳性结果,免疫组化α-actin、myosin、desmin染色阳性细胞数总体可达95％。 冯超等[14]观察第一代细胞荧光显微镜下对α-actin、myosin仅有少量表达。第五代细胞对α-actin、myosin几乎无阳性表达。经过多次贴块培养后细胞对阳性率进一步降低。 宋鲁杰等[15]荧光显微镜下观察到a-actin和Myosin仅有少量表达 ，随传代次数的增加，细胞表达a-actin和 Myosin的阳性率进一步降低。 Abeysinghe HR等[16]得出第二代平滑肌细胞经免疫荧光检测显示α-actin、myosin、desmin均呈阳性反应。但后两者的荧光强度弱于α-actin。同期制备的兔成纤维细胞仅α-actin呈现阳性反应，余下指标均显示阴性。Giovanni等[17]报道的培养方法，培养成功后CMSC其纯度通过检测证实阳性可达α-actin可达97％。
　　国内多采用α-actin单个指标作为鉴定平滑肌细胞鉴定的标准，且对抗体阳性率的方法没有进行很好的阐明[12、13] ,从目前的上来看α-肌动蛋白是一个非常特异性的指标。Pilatz[8]等更倾向于将结蛋白作为鉴别平滑肌细胞的特异性指标。Rajasekaran [18]还支持将α-肌动蛋白结合肌球蛋白作为鉴定平滑肌细胞的指标。Abeysinghe HR研究同期成纤维细胞在这两项指标的检验中均提示阴性，并在进行流式细胞纯度分析的全过程中始终低于α-肌动蛋白表达的阳性率[16],因此可以认为利用desmin结合α-actin是用来鉴别海绵体平滑肌细胞有效的指标。有趣的是，Krall等[5]曾指出结蛋白会在体外培养的时候消失,但把细胞移入不含血清的培养液中继续培养,则又可以诱导细胞合成desmin，陈斌等[9]通过实验得出类似的结论。 Kolodsick[19]认为成纤维细胞体外培养时有向肌纤维母细胞转化的趋势, 在这个过程中α-actin也是表达的，这可能是以往研究中CMSC假阳性的一个重要原因。
　　3   展望 
　　优化CMSC培养的鉴定方法，为研究ED的细胞培养纯度提供保证。但是现在各种鉴定方法特异性值得进一步商榷，其阳性率有待提高，根据CMSC和成纤维细胞细胞膜差异蛋白表达的情况，运用流式分选技术鉴定纯度较高，将是今后研究的方向，另外几种方法联合鉴定可以提高阳性率，逐步提高细胞纯化度，会促进ED病理生理机制的研究新进展，从而促进ED研究和指导临床。
　　文献
　　[1]  Jardin A．Erectile Dysfunction[M].Plymouth ; Health Publication Lid,2000．711-726．
　　[2]  Feldman HA，Johnnes CB，Derby CA，et al．Erectile dysfunctionand coronary risk factors：prospectiveresults from the Msachusetts male aging study[J]．Prey Med，2000，30(40)：328-338．