瑞香狼毒药材中蛋白质部位的体外活性研究

　　从表2可以看出，总蛋白溶液从浓度为2.09 mg·ml-1开始出现抑制肝癌细胞生长的现象，并随浓度增加抑制肝癌细胞生长的强度越大。

　　2.2.3  总蛋白的抑菌实验［7,8］
   
　　菌株的培养：在无菌操作条件下，用接种环取金黄色葡萄球菌菌株一环，用划线法接种在制作好的培养基中，然后用不同接种环分别以同样方法对铜绿假单胞菌进行接种。把各菌种置37℃恒温培养箱中培养24h，然后取出放入4℃冰箱中保存备用。
   
　　供试品溶液的制备：精密称取瑞香狼毒总蛋白样品85.2mg，加入4 ml蒸馏水溶解即得。

　　样品灭菌：将盛有总蛋白样品溶液的小瓶在水浴中煮沸10 min。然后将样品溶液转移至灭菌的试管中，再煮沸10min灭菌即可。
   
　　将每个涂布菌液的培养皿上，均匀的放置6个钢管，每个钢管中滴加一个样品。在滴加过样品的培养皿上盖上陶瓦盖将其密封，于37℃恒温培养箱中培养24h后取出观察样品的抑菌圈。实验结果显示，瑞香狼毒总蛋白溶液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均没有抑菌圈出现，说明瑞香狼毒中蛋白质部位对这两种菌的生长没有抑制作用。

　　2.3   瑞香狼毒分离得到的各分子量蛋白的细胞实验从总蛋白的体外活性研究实验结果可以看出，瑞香狼毒中的蛋白质对细菌生长没有抑制作用，但对肿瘤细胞和正常细胞有抑制和毒性作用。为了进一步确定它的抗肿瘤活性和毒性作用，本实验对从总蛋白分离得到的6个分子量的蛋白质分别进行了细胞活性研究。

　　2.3.1  供试品溶液的配制精密称取蛋白质1～6的粉末，用一级纯化水制成约10 mg·ml-1的溶液，在无菌操作下用0.45μm高压灭菌后的滤膜过滤即得。

　　2.3.2  抗肿瘤活性的实验按“2.2.2”项下方法测定各分子量蛋白对肝癌细胞的作用。结果见表3。表3  瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白质对肝癌细胞生长作用结果（略）

　　表3结果显示，有4个分子量的蛋白对肝癌细胞的生长有抑制作用。它们分别是：分子量为35.0 kDa，肝癌细胞抑制率57.9%；分子量约28.0 kDa，肝癌细胞抑制率57.9%；分子量约23.0 kDa，肝癌细胞抑制率86.8%；分子量94.0 kDa，肝癌细胞抑制率68.4%。

　　2.3.3  对正常细胞的毒性实验按“2.2.1”项下方法测定瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白对正常细胞毒性作用。结果见表4。表4  瑞香狼毒中6个不同分子量蛋白质对正常细胞作用结果（略）

　　细胞毒性实验中，若蛋白质样品的OD值小于空白溶液的OD值，则说明该分子量的蛋白质对细胞有毒性作用。表4显示，OD值小于空白溶液OD值（0.08）的蛋白质有3个，说明这3个蛋白质对细胞有毒性作用。它们的分子量分别是： 14.4 kDa；约28.0 kDa；约23.0 kDa。
   
　　瑞香狼毒总蛋白质的抑菌实验和细胞活性研究结果表明，瑞香狼毒药材中蛋白质部位对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌没有抑菌作用，但有对肿瘤细胞生长的抑制作用和对正常细胞的毒性作用。
   
　　各分子量蛋白的体外活性的研究表明，分子量约为28.0 kDa和23.0 kDa的两个蛋白同时具有对肿瘤细胞生长的抑制作用和对正常细胞的毒性作用；分子量为35.0 kDa和94.0 kDa的蛋白只有对肿瘤细胞的抑制作用；分子量为14.4 kDa的蛋白只有对正常细胞的毒性作用。

　　3  讨论
  
　　瑞香狼毒药材作为常用的蒙药材，具有重要的药用价值。总蛋白的抑菌结果显示，瑞香狼毒蛋白质溶液对这两种菌落的生长均没有抑菌环出现，说明瑞香狼毒中的蛋白质部位对瑞香狼毒药材的抑菌活性没有贡献，不能作为抑菌药物使用。在总蛋白质的体外活性实验中，我们还就其对正常细胞的毒性作用和对肿瘤细胞的抑制作用进行了研究。研究结果显示，瑞香狼毒中的蛋白质部位对正常细胞有毒性作用，同时对肿瘤细胞的生长也有抑制作用，作用强度随着浓度的增加而增强。
   
　　由于瑞香狼毒中总蛋白质部位有抗肿瘤活性和毒性作用，为了确定它的这些功能是由哪些分子量的蛋白质引起的，我们对其分离得到的6个分子量的蛋白质进行了进一步的细胞活性研究。研究表明，6个分子量的蛋白质中有3个对正常细胞有毒性作用，有4个对肿瘤细胞有抑制作用。其中有抗肿瘤活性而没有毒性的有两个，它们的分子量为35.0 kDa和94.0 kDa。

【参考文献】
  　　［1］江苏新医学院. 中药大辞典，下卷［M］.上海:上海人民出版社, 1977：1898.

　　［2］李秀英. 有毒中药鉴别、炮制与保管［M］.北京:科学技术文献出版社,1996:76.

　　［3］曹新伟,冯卫生,狼毒的化学成分研究［J］.河南中医学院学报,2004,6:81.

　　［4］YangBY. 54 Cases of treating malignant tum or with Wtellera chamaejasme［J］.Chin J Integrated Tradit Chin West Med,1989,9(11):683.

　　［5］Lin X, Zu J H. A survey of pharmacological research and clinical application of Stellera chamaejasme［J］.Zhejiang J Tradit ChinMed,1992,27(7):331.

　　［6］司徒镇强,吴军正.细胞培养［M］．西安:世界图书出版社,2007.

　　［7］李立顺,时维静,关 鸣,等．四倍体蒲公英活性成分比较及体外抑菌作用研究［J］.中国实验方剂学杂志,2008,14（6）:55.
　
　　［8］乔海霞,张玉妥,季建军,等.涿鹿蒿不同方法提取液抗菌作用比较［J］.河北北方学院学报,2008,25（3）:14.