正交实验设计优选荠菜多糖的提取工艺研究
作者：许瑞波，毛茜 王吉 刘玮炜 陈小芳 唐秋萍 马卫兴
【摘要】 目的研究荠菜多糖的提取工艺条件。方法以荠菜多糖的提取率为考察指标，以水为提取剂，采用单因素和正交实验设计考察了浸提温度、料液比、浸提时间、超声提取时间和提取次数等因素对荠菜多糖提取率的影响。结果荠菜多糖的最适宜提取工艺条件是：热水浸提温度为70 ℃，料液比(原料粉质量g∶蒸馏水体积ml)为1∶20，热水浸提时间为3 h，然后超声提取30 min，提取3次，此时荠菜多糖的提取率为2.64%。所得粗多糖经Sevag法脱蛋白处理后，其UV扫描图中260～280 nm处的吸收峰明显减小，说明该法可以较好的脱除产品中的核酸、蛋白质。结论该实验为荠菜多糖的提取、纯化提供了一定的理论依据。
【关键词】 荠菜; 多糖; 提取; 超声辅助法
荠菜Capsella bursa-pastoris L.又名护生草、荠菜花等，属十字花科1年或2年生草本植物，共二百余属，二千余种，全草均可入药。荠菜广泛生长于田野、路边及庭院，全国各地均有栽培，是药食同源植物[1～5]。《本草纲目》《现代食用中药》等记载，荠菜有清肝明目、凉血止血、和中、补心脾、杀诸毒之功，这些功能主要归因于其所含的多种天然活性成分: 维生素、矿质元素、氨基酸、生物碱、黄酮类等[4～7]。
虽然我国荠菜资源丰富，但对其活性成分的提取、利用研究并不多。本课题组已经先后对荠菜所含的氨基酸、黄酮类化合物、生物碱等成分[6～9]进行了提取工艺研究，并获得了适宜的提取工艺条件。此外，由于多糖具有多种生物活性，且毒性低，使其在抗体、肿瘤治疗、艾滋病、抗衰老、治疗糖尿病等临床应用方面具有良好的前景[10]。为了进一步有效的开发、利用该资源，本文利用单因素和正交实验设计对荠菜多糖的提取工艺进行了优化，得到了适宜的提取条件。
1 材料与仪器
1.1 原料荠菜于2007年春天购于连云港市菜市场,摘去烂、黄叶，用自来水冲洗干净，经风干后，在真空干燥箱中60℃恒温完全烘干，经粉碎机粉碎，密封备用。
1.2 试剂苯酚(用前蒸馏纯化),硫酸,石油醚，氯仿，正丁醇(均为分析纯)，95%乙醇，蒸馏水。
1.3 仪器KS-150D型超声波清洗机(宁波科生仪器厂)，HH-6数显恒温水浴锅(武汉精华科教仪器有限公司)，UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)，JH723可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。
2 方法
2.1 荠菜多糖提取操作步骤 准确称取10.00 g干燥的荠菜粉末，放入三口烧瓶中，并向该三口烧瓶中加入50 ml石油醚(去除色素等物质)，于水浴中加热回流一定的时间，过滤，将滤渣置于盛有100 ml 80%乙醇的三口烧瓶中，回流提取2次(除去小分子糖类、苷类、生物碱等醇溶性物质，防止其成为水溶性多糖中的杂质)，每次1.5 h，再过滤。将滤渣置于三口烧瓶中，加入一定量的蒸馏水，提取一定时间，再用超声波清洗器超声提取一定时间，然后抽滤得清液，即荠菜多糖提取液。
2.2 荠菜多糖的脱蛋白操作步骤将荠菜多糖提取液用旋转蒸发仪进行浓缩至50 ml左右，移入分液漏斗，然后加入氯仿与正丁醇(V∶V=4∶1)混合液，使浓缩液与混合液的体积比约为3∶1，充分摇振、静置分层，除去白色沉淀层，重复此操作2次。用量筒量取脱蛋白后的多糖溶液的体积，记为V。再用移液管移取1.00 ml此液，置于25 ml容量瓶中定容，即为待测液。然后在剩余多糖提取液中加入其4倍体积的95%乙醇，静置12 h后，过滤，将滤渣放入烘箱中于60℃烘干至恒重，得精制纯化多糖。
2.3 多糖含量的测定及标准曲线的制备以葡萄糖为标准品，用苯酚-硫酸比色法测多糖[10]的含量。参考文献[10]制备标准曲线，得线性回归方程A=4.222 9C+0.019 0，相关系数r=0.999 1，C是浓度(mg/ml)。
2.4 荠菜多糖提取率的计算方法本实验未考察醇沉时，醇用量、醇沉时间等因素对多糖析出量的影响，因此为了准确反应实验所用方法对荠菜多糖的提取效果，以醇沉前溶液中荠菜多糖的含量为准，即精密吸取1 ml “2.2”中定容的待测液，再按照“2.3”项方法测荠菜多糖的含量，即：荠菜多糖提取率 (%)= 荠菜多糖质量÷原料质量×100%=(A-0.019 0)×V1 689.16×100%其中：A为所测得的吸光度，V为“2.2”项中所量得的多糖液体积。
3 结果与讨论
3.1 单因素实验结果
3.1.1 料液比对荠菜多糖提取率的影响提取温度为80℃，浸提2 h，提取1次，考察料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40)对提取率的影响(见图1)。由图1可知。随着料液比的增大，荠菜多糖提取率也逐渐增加，当料液比为1∶30时最大，再增大料液比，提取率反而减少，因此最适宜料液比在1∶30左右。图1 料液比对提取率的影响