白藜芦醇对于异抗原刺激下大鼠T淋巴细胞活化增殖的影响

来源:岁月联盟 作者: 时间:2015-05-19

              作者:王幼黎,赵延红,杨兴武 王建华,武昌学

【摘要】  目的研究白藜芦醇(RSV)对于异抗原刺激下大鼠T淋巴细胞活化增殖的影响。方法建立SD-Wistar大鼠腹腔异位心脏移植模型急性排斥反应模型,分离受体脾脏淋巴细胞与成年供体系SD大鼠心肌细胞体外混合培养,分别给予不同剂量RSV与CSA干预,观察RSV与CSA对体外混合培养下T淋巴细胞增殖的影响;通过ELISA法检测两者对细胞因子IL-2的影响。结果RSV可以抑制共培养细胞中T淋巴细胞增殖,减低培养上清中IL-2活性,作用强弱表现出明显的剂量依赖性,与CSA有协同性。结论RSV在体外淋巴细胞培养中表现免疫抑制作用。

【关键词】  白藜芦醇; 异抗原; T淋巴细胞增殖活化

  白藜芦醇(resveratro, RSV)含芪类结构的非黄酮类多酚化合物,主要来源于蓼科植物虎杖的根茎提取物,具有广泛的生理药理学作用,但对免疫系统的调节作用研究较少,我们初步探讨了RSV对异抗原刺激下T细胞活化、增殖与分化的抑制作用。

  1 材料

  1.1 试药与仪器白藜芦醇、大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒、胶原酶均购自Sigma公司;GIBCO1640培养基购自Invitrogen 公司;酶标仪,BMG公司产品;细胞培养箱,Heraeus公司产品。

  1.2 动物供体采用健康纯系清洁级SD大鼠,体质量约180~220g,雌性,购于西安交通大学动物实验中心;受体选用健康纯系清洁级Wistar大鼠,雄性,体质量约180~220g,购于北京试验动物中心。

  2 方法

  2.1 SD大鼠对Wistar大鼠异位腹腔心脏移植模型的建立供受体术前禁食8~12 h,自由进水。供受体麻醉采用氯安酮(50mg/kg)腹腔注射,手术在清洁条件下进行。

  2.1.1 供体手术SD大鼠麻醉后, 由下腔静脉全身肝素化后,于胸主动脉根部切断主动脉及下腔静脉, 将心脏、肺脏以及胸腺组织联合切取。

  2.1.2 供心体外修剪及心脏保存供心置于0~4℃无菌乳酸林格氏液修整, 分离升主动脉及肺动脉, 游离并结扎左肺动脉,游离保留右肺动脉,长度约6~8 mm作为流出道。将胸主动脉干上左颈总动脉分支(第2分支)修剪保留至约3 mm,做为流入道,并将胸主动脉远端结扎,上、下腔静脉和所有肺静脉一次集束结扎。制作直径为3 mm的Cuff套管,将右肺动脉穿过套管,并将动脉近端翻转包绕Cuff套管,丝线结扎固定,经Cuff套管经右肺动脉使用0~4℃无菌乳酸林格氏液供心灌注驱血。

  2.1.3 受体手术Wistar大鼠麻醉后, 左腹部T形切口, 游离左肾动、静脉, 近肾门处切断左肾动静脉, 左肾切除。供心左颈总动脉与受体左肾动脉以袖套法吻合,受体左肾动脉末端套入供心左颈总动脉(第2分支),将供心右肺动脉Cuff套管插入受体左肾静脉结扎固定。依次开放左肾动脉、左肾静脉,供心节律性收缩后,关腹,自由进食饮水。

  2.2 受体Wistar大鼠淋巴细胞分离与培养

  2.2.1 受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液制备术后第7天,处死大鼠消毒后,无菌开腹取脾,Hanks液洗涤,剪碎脾脏、研磨,过40目滤网,制备受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液。

  2.2.2 淋巴细胞分离与培养受体Wistar大鼠无菌脾细胞悬液淋巴细胞分离液分离。Hanks液洗涤两次,RPMI1640培养液将细胞配成5×106/ml的细胞悬液备用,置于37℃,5%CO2的恒温培养箱中孵育。

  2.2.3 大鼠心肌细胞原代培养及模型建立[1]无菌解剖供体系SD大鼠心脏,经Langendorff灌注架37℃连续灌注无钙台氏液 60 ml, 消化酶30 ml循环灌注12 min,再用含0.06 mol/L Ca2+的台氏液60 ml灌注。在含100 μmol/L Ca2+的KB液中剪碎心脏,37℃轻摇10 min,200 μm滤网过滤,将滤液900 r/min离心1 min,弃上清,加入含500 μmol/L Ca2+的KB液900 r/min离心1 min,再用含1 mmol/L Ca2+的KB液重复1次, 用差速贴壁分离法纯化并于血细胞计数板上计数, 1640完全培养液调细胞浓度为2×107/ml。分两培养瓶,其中一瓶内加入丝裂霉素(25 mg/ml)去增殖活性备用。

  2.2.4 大鼠脾细胞悬液加入经丝裂霉素处理的大鼠心肌细胞共培养用1640完全培养液配成1×106/ml的大鼠脾细胞悬液100 μl加入1640完全培养液调配成浓度为2×107/ml大鼠心肌细胞培养液100 μl,加IL-2(20 U/ml)加双抗(青霉素100 mg/L,链霉素100 万U/L)。

  2.3 实验分组每孔加入不同浓度RSV、CSA培养,A:空白; B: CSA 100 nmol/L;C1: RSV 50 μmol/L; C2: RSV 100 μmol/L; C3: RSV 25 μmol/L; D: CSA 100 nmol/L, RSV 50 μmol/L; E: CSA100 nmol/L, RSV 37.5 μmol/L。

  2.4 实验组内加入不同干预药物共培养细胞中T淋巴细胞增殖抑制率各试验组共培养5 d后。吸取细胞悬液,离心收集上清液, 置-20℃冰箱保存备用,进行IL-2活性测定,分离淋巴细胞,RPMI-1640不完全培养液洗涤2次, 加入RPMI-1640不完全培养液5 ml, 将淋巴细胞悬液通过尼龙柱除去B淋巴细胞,贴壁法去除单核细胞,完全培养液配成5×106/ml,设阴性对照孔(RPMI-1640不完全培养液),每孔反应总体积100 μl,每孔设4个复孔,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),培养4h,然后加入DMSO 150 μl,充分振荡后,全自动酶标仪490 nm波长进行比色分析,测定此波长下的光密度值OD值,T淋巴细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值- 空白OD )/(阴性对照组OD值- 空白OD)]×100%。

  2.5 IL-2活性的测定 无菌制备活的正常未手术Wistar大鼠脾淋巴细胞,制成5×106/ml细胞悬液,加入ConA使其终浓度为5 μg/ml,置37℃,5%CO2培养箱中培养48 h,收集细胞,离心洗涤2次,用完全RPMI1640配成0.5×105/ml细胞悬液,作为检测IL-2活性的反应细胞。

  取-20℃保存的IL-2上清液,并做1/2和1/4的稀释,在96孔平底培养板中,每孔加入IL-2上清液或不同稀释度的IL-2的上清液100 μl及上述作为反应细胞正常未手术Wistar大鼠脾淋巴细胞100μl,对照组不加IL-2上清,加100 μl 1640培养液。每组各设5个复孔,置37℃,5%CO2培养箱中培养48h,每孔加MTT(5 mg/ml)10 μl,继续培养4h吸100 μl上清液,加入酸化异丙醇100 μl(0.01 mol/L),充分振荡10 min后,全自动酶标仪用560nm波长进行比色分析。

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