氧耗剂致乳鼠心肌缺氧/复氧模型的建立

              作者：余薇，许波，彭彦，吴基良，李璐

【摘要】  目的探讨利用氧耗剂建立乳鼠心肌缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法取SD乳鼠原代心肌细胞培养，观察氧耗剂连二亚硫酸钠不同浓度(1，2，3，4，5 ，6 mmol/L)分别缺糖缺氧1 h复氧 24 h及在4 mmol/L浓度下缺糖缺氧不同时间(5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h)后复氧24 h对心肌细胞存活率及培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的影响，并进行细胞形态学观察。结果乳鼠心肌细胞经过缺氧/复氧处理后，与正常对照组相比，连二亚硫酸钠可呈浓度依赖性降低心肌细胞存活率，尤其 Na2S2O4 浓度大于3 mmol/L时细胞MTT的OD值与正常对照组有显著性差异，同时上清液中LDH含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。而当连二亚硫酸钠4 mmol/L浓度下随着缺氧时间延长，细胞的存活率显著降低，而心肌细胞上清液中LDH的释放量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，呈现时间依赖性。结论应用连二亚硫酸钠可建立心肌细胞缺氧再灌注损伤模型。

【关键词】  心肌细胞; 缺氧; 复氧; 细胞模型; 连二亚硫酸钠

　　Abstract：ObjectiveTo establish hypoxia/ reoxygenation model in neonatal rat cardiomyocytes by oxygen agent.MethodsCultivate neonatal rat cardiomyocytes, observe the apoptotic cardiac myocyte by using MTT assay and after being given Na2S2O4 with different concentration (1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 mmol )for 1h and then reoxygenation for 24h;besides give Na2S2O4 with 4 mmol/L at different time(5, 15,30 min,1,2 ,4 ,6 h )and then reoxygenatie for 24 h.Biochemical method was used to determine lactate dehydrogenase (LDH) activity. ResultsNa2S2O4 could increase cell apoptosis and the level of lacate dehydrogenase (LDH) the supernatant fluid.ConclusionIt is an effective hypoxia/ reoxygenation mode of using Na2S2O4 in neonatal rat cardiomyocytes.

　　Key words： Myocardial cells; Hypoxia; Reoxygenation ; Cell mode; Na2S2O4

　　心肌缺血/再灌注损伤是临床常见的病理过程，探讨其发病机制并寻找有效的防治措施是目前医学研究领域的一项重要内容。制备离体乳鼠心肌局部缺血/再灌注模型是进行相关研究的常用方法。因此，制备简便易行、稳定可靠的缺血/再灌注模型具有重要的实用价值[1]。鉴于以上原因，本文通过氧耗剂连二亚硫酸钠致心肌缺氧的最佳浓度和时间寻求制备一种稳定简便的心肌缺氧再复氧模型。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物Sprague Dawley 0～2日龄乳鼠15只(华中科技大学同济医科医学院实验动物中心提供，准字号：SCXK 2004-007)。

　　1.2 药品与试剂连二亚硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑溴盐即噻唑蓝3-(4,5-dime-thylthiaml-2y1)-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT) ( sigma公司;胰酶(1∶250 Amresco公司);胎牛血清 (浙江杭州四季青公司);DMEM培养基(GIBCO);5-溴脱氧尿嘧啶(SIGMA);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.3 主要器材ALE-200型电子分析天平(湘仪天平仪器厂);YXJ-1型离心机(SIGMA); CO2 培养箱(HERAEUS);酶标仪(MAGELLAN);CKX41型倒置显微镜(OLYMPUS)。

　　2 方法

　　2.1 心肌细胞培养[2,3]将含 10 % 胎牛血清的DMEM培养基无菌分装，预先置于 37℃，5 % CO2 培养箱中温育饱和。取新生 Sprague-Dawley 乳鼠 15只，消毒后放入无菌操作台上，无菌条件下开胸取心，立即用冰 D-hanks' 液洗去残血，剪成 1 mm×1 mm×1 mm 大小的碎片，加入适量的 0.1 % 胰蛋白酶，置37 ℃水浴中振荡10 min消化，去上清，沉淀继续用0.1% 胰酶37 ℃ 水浴，分次消化并经 200 目一次性筛网过滤成单细胞悬液后，加入血清培养基终止消化后 1 500 r/min离心 5 min，收集沉淀，加入含5-溴脱氧尿嘧啶的正常培养液于37 ℃，5 % CO2饱和湿度条件下差速贴壁 2 h 后，调整细胞浓度至(1~5)×106 / L，每孔300 μl 接种到96 孔培养板上，置入37 ℃，5 % CO2 饱和湿度培养箱中继续培养，于接种48 h后换正常培养基继续培养。

　　2.2 连二亚硫酸钠缺氧复氧模型制备

　　2.2.1 不同浓度连二亚硫酸钠对心肌细胞的影响 取培养4 d的心肌细胞，随机分为8组，每组12孔：①正常对照组，用高糖DMEM孵育;② 单无糖 Earle'S液组;③连二亚硫酸钠1， 2，3，4 ，5，6 mmol/L+无糖 Earle'S液组;置37 ℃，5 % CO2中培养，于1 h后换高糖DMEM继续培养24 h。重复两次。

　　2.2.2 不同作用时间对心肌细胞的影响将培养4 d 的心肌细胞随机分为8组，每组12孔：①对照组，用高糖DMEM孵育;②连二亚硫酸钠4 mmol/L +无糖 Earle'S液分别缺氧5 min，15 min，30 min， 1，2，4，6 h后换高糖DMEM液继续培养24 h。重复两次。

　　2.3 相关指标测定

　　2.3.1 MTT 法细胞存活率测定吸弃 96 孔板各孔液体，加入 DMEM 培养基 270 μl，再加入5 g/L MTT 工作液 30 μl 混匀，37 ℃孵育 4 h ，弃去孔内培养液，每孔加入 270 μl DMSO，振荡 10 min 使充分溶解。酶标仪 490 nm 波长测量各孔OD值。以正常组OD值为对照，计算各孔细胞存活率(﹪)= 各组OD值均值/正常组OD值均数 × 100%。