广东土牛膝及咽炎方合剂中12,13-二羟基泽兰素对照品的制备
2.1.2 制备型HPLCKromasil C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水-甲醇(65∶35);检测波长254 nm，流速5 ml·min-1，进样量0.5 ml。
2.2 广东土牛膝在咽炎方合剂中的特征成分确定咽炎方合剂系由广东土牛膝、岗梅、甘草等中药水煎煮浓缩而成，广东土牛膝是方中君药。用HPLC对咽炎方合剂、广东土牛膝水煮液和乙醇提液、咽炎方缺广东土牛膝阴性溶液进行分析，选择广东土牛膝在制剂中峰面积最大的成分作为分离纯化目标。如图1所示，峰1为咽炎方合剂与广东土牛膝水煮液相对应的色谱峰，确定其为目标化合物。由于峰1在广东土牛膝乙醇提取液中含量较高，选择用95%乙醇提取广东土牛膝药材，制取浸膏供分离对照品用。
2.3 对照品的分离与制备取广东土牛膝药材3 kg，粉碎，95%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。合并提取液，减压浓缩，得乙醇提取物50 g。取乙醇提取物与水混悬，依次以石油醚、乙醚、正丁醇萃取，得石油醚萃取物23 g，乙醚萃取物3.6 g和正丁醇萃取物5 g。分别取3种萃取物进行HPLC分析(见图2)发现拟分离化合物主要在乙醚萃取层。取乙醚萃取物干法上样于硅胶(200～300目)柱，二氯甲烷-丙酮(16∶1)洗脱，合并薄层色谱斑点相同部分，得到粗品0.4 g，经HPLC面积归一化法计算，拟分离化合物质量分数为70%。A咽炎方样品溶液 B咽炎方广东土牛膝缺位样品溶液 C广东土牛膝乙醇提取液 D广东土牛膝水煮液 1.目标化合物 图1 供试品溶液色谱图(254 nm)A石油醚萃取物 B乙醚萃取物 C正丁醇萃取物 1.目标化合物图2 萃取物色谱图(240 nm)将粗品溶于50 ml 35%甲醇，作为制备液相色谱供试品溶液。按制备型HPLC色谱条件对粗品进行纯化，收集保留时间在20～23 min的组分(见图3)在50℃减压浓缩后冷冻干燥，得淡黄色粉末100 mg。图3 供试品溶液的制备型HPLC图
2.4 结构鉴定淡黄色针状结晶(甲醇)。熔点121～122 ℃。UV(MeOH)λmax nm：240，265，348。IR(KBr)νmax cm-1：3440，2446，1643，1384，1163，1070，950，860，547。ESI-MS:：m/z 249.0759[M-H]-，确定分子式为C13H14O5。NMR数据见表1 NMR数据与文献报道基本一致[5]，确定其结构为12，13-二羟基泽兰素，结构见图4，为首次从该植物中分离得到。
2.5 对照品的纯度检测
2.5.1 HPLC检测取对照品适量，用甲醇配成浓度为250 μg·ml-1的溶液，按色谱条件进样分析，对照品主峰与杂质峰分离度为8.2。色谱图见图5。用Empower软件计算得到对照品主峰的纯度角度为0.42，纯度阈值为0.71，角度和阈值均小于1，且前者小于后者。根据Waters色谱工作站的色谱峰纯度理论，表明对照品的峰光谱均匀，纯度较高，可认为是单一物质峰。
2.5.2 TLC检测取对照品用甲醇配制成浓度为5.0 mg·min-1的溶液，做为供试液，另取供试液稀释成浓度为0.1 mg·min-1，作为对照液，取供试液和对照液各10 μl点于同一硅胶板上，以二氯甲烷-丙酮(7∶1)为展开剂，以10%硫酸乙醇为显色剂，105 ℃加热3 min，置紫外灯365 nm下观测，供试液除主斑点外，只出现一个杂质斑点，且小于对照液，表明制得的对照品含量大于98.0%。表1 对照品的NMR数据 图4 12，13-二羟基泽兰素结构式图5 12，13-二羟基泽兰素的分析型HPLC图
3 讨论
以广东土牛膝为主药的复方制剂在广东地区的医院常被用于治疗急慢性咽喉炎、扁桃体炎等咽喉疾病，疗效确切，但由于其为地方药材，对照品的缺失成为其质量控制的瓶颈，药材及其制剂质量标准一直未有含量测定方法[6]，广东土牛膝复方制剂的质量控制主要有对广东土牛膝进行薄层鉴别[7，8]，测定制剂的总黄酮含量[7，9]等，对制剂中广东土牛膝的化学成分研究很少。本实验通过分析咽炎方合剂中广东土牛膝的特征成分，结合广东土牛膝水提液的指纹图谱，选取两者均含有的成分作为定量指标的目标化合物，进行分离、纯化，得到12，13-二羟基泽兰素，可作为广东土牛膝药材和咽炎方合剂的质量控制以及药效物质基础研究用的化学对照品。
在用制备液相色谱纯化前，先把乙醚层萃取物通过硅胶柱色谱预处理，初步净化去除了样品中大量的杂质，使12,13-二羟基泽兰素的含量进一步提高，防止污染色谱柱。
选用205～400 nm的检测波长对样品进行纯度分析，确定主成分峰为单一物质峰，表明在此色谱条件下，主成分12，13-二羟基泽兰素和杂质分离完全。
HPLC和TLC两种检测方法测定对照品纯度，含量均大于98.0%，符合中药对照品要求。
【参考文献】
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