活性炭对酥梨汁色素的吸附研究

　　摘要链霉菌是放线菌中非常重要的一个属,具有广泛的物种多样性和代谢多样性,它能产生多种抗生素和其他活性物质,在临床和农业上具有广泛的应用。但是,由于链霉菌普遍存在的遗传不稳定性,大大限制了其功能的发挥。因而,除了通过新的技术手段筛选新的活性菌株,研究人员多采用对现有链霉菌的改造育种来实现抗生素产量的提高和稳定,或者生产新的抗生素。主要论述了链霉菌育种中常用的4种方法,即物理诱变、化学诱变、生物工程改造和复合诱变。同时,引证近年来链霉菌育种实例,对这些育种方法的作用机制进行了简要的阐述和总结。
　　关键词链霉菌;育种方法;作用机制
　　
　　自从1943年Waksman首先从链霉菌中发现链霉素来,放线菌就成为抗生素、酶及其抑制剂等活性物质的重要产生菌[1]。目前已经被分离和描述的放线菌至少有180个属,4 000多种[2]。采用传统的方法,分离新的放线菌和新的活性物质,已经变得非常困难[3]。对已知的抗生素产生菌进行改造和育种,从而使其产生新的抗生素或使原有抗生素的产量和质量得以提升[4]已经成为各国学者研究的新热点和方向。就链霉菌的育种方法进行了系统的整理,结合近几年的育种实例,对育种方法及其作用机制进行了简要的阐述和总结。
　　
　　1物理因素诱变育种
　　
　　物理因素诱变的方法主要包括紫外线诱变、激光辐照诱变、微波诱变、离子注入诱变和空间作用诱变等。其中,激光辐照诱变又分为He-Ne激光诱变、铜蒸汽激光诱变和快中子辐照诱变3种。
　　1.1紫外线诱变
　　紫外线是一种使用时间长、效果好,诱发设备简单的诱变剂。绝大多数的高产抗生素产生菌都使用过紫外线诱变进行育种[5]。通常将放线菌制成孢子悬液,用30 W波长稳定的紫外灯在30 cm处进行照射,期间用磁力搅拌器对悬液进行搅拌,使其接受均匀。处理完成后,为防止回复突变,应暗处涂布并于黑暗培养。黄世文等[6]对淡紫色吸水链霉菌进行紫外线诱变后,获得的菌株发酵液对受试菌水稻纹枯病抑菌效果较诱变前有明显提高,同时证实了处在生长分裂初始阶段的链霉菌对紫外线作用较敏感,易发生变异。黄永春等[7]以吸水链霉菌海南变种为出发菌,经连续2次紫外诱变后选育出对小麦赤霉菌有很好抑菌效果的高产菌株,菌株产抗生素能力比初始菌株提高了30.06%,且在斜面连续传代5次后仍有稳定的遗传性状。李继安等[8]将经紫外线诱变处理的博来霉素产生菌孢子涂布在含链霉素的培养基平板上,筛选出可抗性突变菌株,产量阳性效率达到了12.6%。
　　1.2激光辐照诱变
　　使用一定量的激光照射菌体,激光的能量被菌体内部的生物大分子吸收,引起分子激发光解离以及自由基反应,而引起菌体生物性状发生改变,为优良菌种的选育提供了大量的原材料。激光辐照诱变依据其所用的激光类型不同,主要分为He-Ne激光诱变、铜蒸汽激光诱变和快中子辐照诱变3种。
　　He-Ne激光对生物的诱变机制在于红激光能提高染色体结构的机能状态,增加有效分裂活性,使细胞处于易变状态,通过多光子的吸收而聚积能量,并进行再分配而引起DNA分子的损伤和突变。吴振倡[9]用He-Ne激光辐照龟裂链霉菌高产株单孢子悬液20 min,曾获得高产菌株5221,其发酵单位比未辐照菌株提高了5%。此外,吴振倡[10]还首次报道了应用铜蒸气激光辐照龟裂链霉菌获得高产辐照株,其产量平均提高了10%以上。发酵单位达到国际先进水平。吴振倡等[11]报导铜蒸气激光辐照金霉素链霉菌30 min得到激光高产株,其发酵单位比对照提高12.5%。快中子是一种理想的诱变剂,刘路[12]利用快中子诱变洁霉素产生菌林肯链霉菌,使其摇瓶效价提高了17%。
　　1.3微波诱变
　　微波是一种电磁波,使用微波进行链霉菌的诱变操作简单,安全可靠。微波能够刺激菌体细胞内水分、蛋白质、核苷酸、碳水化合物等极性分子的快速运动,这种快速运动所引起的摩擦可以使细胞内DNA之间的氢键和碱基堆积力破坏,DNA结构发生改变,从而引起遗传上的变异。涂璇等[13]通过微波作用对链霉菌702菌株孢子进行不同时间诱变处理,以庆大霉素为致死突变标志,获得了高产抗真菌活性物质的菌株,其摇瓶发酵单位提高了49.9%。郭峰等[14]以微波对南昌链霉菌进行了微波育种,获得了梅岭霉素杀菌剂生产能力高于出发菌株73%的新菌株,多次传代后遗传性状保持稳定。陈力力等[15]利用微波诱变方法对井冈霉素产生菌吸水链霉菌井冈变种进行诱变处理,挑取单个菌落摇瓶初筛、复筛、测定化学效价,获得的4株突变株比出发菌株分别提高了17.5%、15%、20%、21.7%。连续传代4次,代间化学效价差异不明显,遗传性能稳定。由此可见,微波诱变所导致的产量变化差异较大,但遗传性能稳定性较高,因而可以通过扩大诱变原始菌株数量,增加诱变次数等方式增加获得理想突变株的几率。
　　1.4离子注入诱变
　　离子注入是将低能的离子注入生物体内,通过复杂的能量传递、质量沉积和电荷交换,使染色体发生畸变[16],使裸露的单链和双链质粒DNA发生断裂[17],碱基发生突变[18]等。离子注入不仅可以直接引起碱基分子结构的改变,还可以参与细胞的重组和修复。具有突变率高、突变谱广的优点,容易获得酶活力高的突变株。刘晓秋等[19]用低能N+离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,检测到碱基发生转换、颠换和缺失,其中胞嘧啶发生突变频率最高。向砥等[20]利用离子注入诱变选育高产的壮观链霉菌,获得的高产菌株效价较对照提高了102.3%,可见离子注入诱变较容易获得活力高的突变菌株。
　　1.5空间作用诱变
　　空间作用诱变育种是利用空间技术设备(生物卫星、航天飞机等空间飞行器)搭载微生物材料,通过外层空间特殊的物理环境的作用,如微重力、强辐射、低真空等,从而使菌种的DNA分子结构发生变异和重组,得到新的菌种。王璋、刘新征等[21]将链霉菌WZFF.L-M1搭载“神舟”四号飞船进行空间育种,结果筛选出5株遗传性能稳定的菌株,产酶能力提高了30%以上。尽管空间作用诱变对于链霉菌的选育具有良好的效果,但是由于搭载工具造价高昂、程序复杂等因素制约,空间诱变并非主流的诱变方法。除此之外,还有60Co λ射线育种、离子束诱变育种、通电处理诱变育种等物理方法。这些诱变方法也取得了一定的诱变成果。
　　
　　2化学因素诱变育种
　　
　　化学因素诱变育种主要是指利用一系列的化学物质,如亚硝基胍、盐酸羟胺、亚硝酸、抗生素、氯化锂、吖啶橙等物质,对链霉菌进行处理,导致基因组中碱基对发生转换、缺失和异位等,如氯化锂可导致AT-GC碱基对发生转换或碱基缺失,从而导致代谢途径等发生改变,产生高产的优良菌株。当前在链霉菌诱变育种上应用的主要是甲基磺酸乙酯、亚硝基胍和氯化锂。涂璇等[22]利用亚硝基胍诱变链霉菌702菌株,获得的高产突变株20-29-12,产素单位比出发菌株提高了38.08%。朱非等[23]以林肯链霉菌947-8为出发菌株,采用孢子热处理方法处理出发菌株孢子,后进行NTG诱变处理,得到的突变株,产林肯霉素为1 218 γ/mL,产量稳定。黄晶等[24]利用硫酸二乙酯对金霉素链霉菌进行诱变,菌株的正突变率达到52%。由此可见,化学诱变的效率也是非常高的,对于链霉菌抗生素产量的提高有非常重要的作用。