溃克灵对溃疡性结肠炎模型大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群的影响
作者：周红光，陈海彬，徐肇敏，于成功
【摘要】 目的建立溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型，研究溃克灵(KKL)对大鼠UC的治疗作用及对大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ 调节性T细胞的影响，探讨KKL防治UC的作用机理。方法采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)法(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)灌肠复制出UC大鼠模型。将72只大鼠随机分为正常组，模型组，SASP(柳氮磺吡啶)组，KKL大、中、小剂量组;观察结肠大体形态损伤、组织学变化，测定各组大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群百分率的变化。结果与模型组相比，KKL各组、SASP组结肠大体形态损伤、组织学变化显著改善。与正常组比较，模型组大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群降低非常显著(P<0.01)。而经KKL、SASP治疗3周后，大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群，均有显著或非常显著性增高(P<0.01或P<0.05)。结论 KKL对大鼠UC有显著的治疗作用,提高模型大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ 调节性T细胞可能是其治疗机制之一。
【关键词】 溃克灵; 溃疡性结肠炎; 中药; CD4+ CD25+ 调节性T细胞
溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种原因不明的炎症性肠病，以慢性过程、反复发作为其特征，被世界卫生组织列为现代难治病之一。此病病程长，病情复杂，迁延难愈。由于其发病机制不清，目前尚缺乏特异性的治疗措施。溃克灵(KKL)经临床应用，在治疗UC中疗效显著。故笔者结合大量文献、前期实验研究及临床经验，研究其对UC模型大鼠的疗效和对大鼠外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ 调节性T细胞的影响，对其作用机理进行了探讨。
1 材料与仪器
1.1 动物 采用SPF级Wistar大鼠72只，体质量160~200 g，雌雄各半，由南京中医药大学实验动物中心购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(沪)2003-0003;实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002-0123。
1.2 药物、试剂及仪器溃克灵由猴头菌、半枝莲、败酱草、马齿苋、白芍、槐花、厚朴、土茯苓等按特定剂量比例组成，为南京市鼓楼医院消化科课题组原创组方，中药制剂购自江阴天江药业有限公司，95℃水浴浓缩，使每毫升含原药材1.28 g。药物制成后，高压灭菌消毒分装，4℃冰箱保存备用。常态宁(柳氮磺吡啶，SASP)：0.25g/片，批号：20080601，山西三九同达药业有限公司生产。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国sigma公司生产，批号为(2008-16-2)。鼠IL-8酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自美国Pierce公司。KQ-250E电动玻璃匀浆机;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机;55P-7高速冷冻离心机;MDF-U281超低温冰箱等。
2 方法
2.1 造模方法成年Wistar大鼠72只，适应性喂养1周，观察大鼠进食、饮水、活动、大小便情况，确定大鼠健康后，全部大鼠禁食(不禁水)24h，随机分为造模组(60只),对照组(12只)。用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，将造模组大鼠固定，将直径2.0 mm长12 cm的输液管经液体石蜡润滑后,由大鼠肛门轻缓插入深约8.0 cm处, 一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)用橡胶输液管轻缓注入距大鼠肛门约7~8 cm深的肠腔内留置，将大鼠头向下倾斜45°，放置1 min，然后保持平躺状态自然清醒。对照组12只大鼠予上述方法等量生理盐水灌肠。
2.2 药物制备及剂量计算溃克灵成人用药39 g/d，以成人体质量60 kg估算，剂量为0.65 g/kg。参考相关文献，根据人与动物等效剂量换算方法(通过体表面积换算)，大鼠小、中、大剂量按照成人用量的5，10，20倍计算，即3.25，6.5，13 g/kg。1.28 g/ml溃克灵药物用蒸馏水配成325，650，1 300 g/L，大鼠灌胃给药体积为10 ml/kg。SASP：成人用量每天3 g，以成人体质量60 kg估算，成人用量约0.05 g/kg，大鼠取10倍成人用量即0.5 g/kg，药物用蒸馏水配成50 g/L，大鼠灌胃给药体积为10 ml/kg。
2.3 分组与给药造模后第3天，将造模组大鼠按性别、体质量分层随机法分为5组：模型组，溃克灵小、中、大剂量组，SASP组，每组12只;对照组大鼠12只，为正常组。雌雄分笼饲养。同时开始按照上述剂量给药，模型组及正常组给等体积蒸馏水，每天1次灌肠，连续给药21 d。
2.4 标本采集与处理大鼠禁食24 h(不禁水)后，眼眶取血3 ml,经3 500 r/min,15 min低温离心,分离血清500 μl，置-80℃冰箱贮藏，以备检测。采血后断头处死，迅速剖腹，取出距肛门8 cm以上处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲洗肠内容物，滤纸吸干，修取病变最明显处结肠组织进行肉眼观察，将标本用10%福尔马林固定，24 h后进行漂洗，逐级酒精脱水,二甲苯透明,石蜡定向包埋;5 pm厚切片,HE染色,中性树脂胶封片,光镜下观察。
2.5 外周血和肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群检测(流式细胞仪)取肝素抗凝的外周血和制备的肠系膜淋巴结细胞悬液各100 μl，置于流式专用管中，分别加入上述荧光素标记的抗体，其中FITC-CD4，Percp-CD3各4 μl，PE-CD25 1.5 μl，室温避光孵育30 min后，外周血中加入红细胞裂解液(1∶9稀释)2 ml/管，室温放置15 min。所有样本均于1 500 r/min 离心20 min，弃上清液，用冷PBS液3 ml洗2次，最后用0.5 ml PBS重悬，上机(Becton Dickinson)检测。
2.6 统计学方法所有数据均输入计算机，采用SPSS13.0统计软件处理，实验数据以±s表示，根据方差齐性采用单因素方差分析和q检验。
3 结果
3.1 各组主要症状及体征变化比较 造模后第2天，模型组大鼠出现腹泻，为黄色稀便、半稀便甚至血便。此时大鼠毛色失去光泽，活动及进食明显减少，体质量下降，喜贴边及扎堆，反应迟缓、懒动。用药后7 d KKL大剂量组大鼠精神渐恢复正常，毛色渐有光泽，食欲增加，活动逐渐增多，大便在第2周转为稀便后逐渐正常。用药后第8天 KKL中、小剂量组及SASP组大鼠的精神开始恢复正常，毛色渐有光泽，食欲增加，活动也逐渐增多。正常组大鼠则无上述精神、食欲、活动、毛色异常以及大便变化。
3.2 各组大鼠大体形态及组织病理改变比较 正常组大鼠结肠黏膜上皮完整，黏膜下血管正常，无充血水肿，腺体排列整齐;模型组大鼠结肠黏膜不同程度充血、水肿、糜烂，溃疡形成，病变以结肠下段最明显;镜下黏膜及黏膜下层血管高度扩张充血，大量炎细胞浸润，腺体破坏，结构紊乱;溃克灵各剂量组及SASP组可显著改善结肠黏膜的充血、水肿、糜烂，黏膜及黏膜浅层仅有少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润。其中溃克灵中剂量组疗效最佳，且优于SASP组。
3.3 对外周血CD4+ CD25+ T细胞亚群的影响表1结果表明，与正常组比较，模型组大鼠外周血CD4+ CD25+ T细胞亚群降低非常显著(P<0.01)。而经KKL、SASP治疗3周后，大鼠外周血CD4+ CD25+ T细胞亚群，均有显著或非常显著性增高(P<0.01或P<0.05)。表1 溃疡性结肠炎大鼠外周血CD4+ CD25+T细胞亚群百分率的变化
3.4 对肠系膜淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群的影响表2结果显示，与正常组比较，模型组大鼠淋巴结CD4+ CD25+ T细胞亚群降低趋势与外周血非常相似(P<0.05)。而经KKL、SASP治疗3周后，CD4+ CD25+ T细胞亚群出现非常显著性增加(P<0.01或P<0.05)。表2 溃疡性结肠炎大鼠淋巴结CD4+ CD25+T细胞亚群百分率的变化
4 讨论
溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn' s disease，CD)均属于炎症性肠病 (inflammation bowel disease，IBD)，近年来发病率呈逐年上升趋势[1]。UC病因和发病机制尚不明确，免疫系统调节异常可能是UC发病的重要环节。有研究[2]表明肠道黏膜免疫-炎症反应的异常在UC的发病中占着非常重要的地位，T细胞是参与这一反应的主要免疫细胞。
正常情况下，人的消化道中寄生的大量细菌对于肠道黏膜免疫系统是一个极大的挑战，两者之间保持一定的免疫平衡和耐受，肠道因而发挥正常的生理功能。如果肠道黏膜免疫-炎症反应失调时，那么就必然导致肠道黏膜受损，从而引发结肠炎症。T细胞是正常黏膜免疫反应中的一个关键的免疫细胞[3]，主要是通过TCR介导识别抗原、活化后，发挥细胞毒作用和分泌细胞因子而产生效应;具有保护肠道黏膜、清除受损的上皮细胞、抵御外来抗原的入侵、以及有助于内环境的平衡从而发挥肠道正常的生理功能等。另一方面，除具有上述保护作用外，T细胞就像把“双刃剑”，假若效应 T细胞或调节细胞功能异常时，又具有诱导黏膜损害和结肠炎症等损害的作用。
因此，肠黏膜屏障功能的完整是维持肠黏膜正常功能的基础，黏膜屏障功能的缺陷有利于微生物抗原进入肠黏膜固有层，诱发异常的黏膜免疫应答。效应T细胞的活化是肠黏膜免疫及其后续炎症的起点。外周T细胞亚群中，已明确CD4+ T细胞是导致肠黏膜炎症的主要效应细胞，因为到目前为止所研究的所有结肠炎模型中黏膜组织浸润中最主要的细胞类型即为CD4+ T细胞;而且在一些研究中，体内删除CD4+ T细胞，炎症即好转[4]。