Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白研究进展
【关键词】 Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白 转录因子 真菌
锌指(zinc fingers)是指含有Zn2+的可与DNA相互作用的蛋白质基序(motif)，含有锌指基序的转录因子是一个大家族。目前已发现10多种不同种类的锌指基序，Zn(Ⅱ)2Cys6型锌指基序就是其中的一种，其组成是CysX2CysX6CysX5-12CysX2CysX6-8Cys，此基序中的半胱氨酸与2个锌离子结合。含有此基序的转录因子被称为Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白，仅存在于真菌中。1982年分离出的第一个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白是Gal4p［1，2］，Gal4p是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）半乳糖代谢相关基因的转录调节因子，在半乳糖存在下可以激活半乳糖代谢相关基因的转录。
Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可参与调节真菌的基础代谢、次级代谢、药物抗性及减数分裂等过程，其中对真菌次级代谢中相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的研究将有助于了解真菌的次级代谢的调控过程。
1 Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的结构及其作用方式
对已知的多种真菌的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白的结构分析表明，从蛋白质的氨基端到羧基端分别由DNA结合域（DBD，DNAbinding domain）、调控域(regulatory domain)和酸性域(acidic region)组成。其中DBD又可分为锌指结构域(Zinc finger domain)、连接区域(linker region)以及二聚化区域(dimerization region)，在二聚化区域常含有螺旋的螺旋结构（Coiledcoil）。Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以单体、同源二聚体或异源二聚体的方式与DNA相互作用。个别锌簇蛋白的DBD结构域位于羧基端［3］。有时Zn2+可被其它金属离子所替代，如Cd2+可取代Gal4p中的Zn2+［4］。调控域与锌簇蛋白对靶基因的转录激活功能有关，如果缺失该区域，可能造成靶基因的表达被持续激活，即该区域可能是起到抑制转录激活的作用。羧基端的酸性域是转录激活域。
Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白结合于目标基因的启动子区的DNA序列，所结合的DNA元件的保守序列是单个或重复的三核苷酸序列CGG［5］，结合的特异性与CGG三联体的方向、三联体之间的距离及CGG周围的碱基序列有关，常见的结合序列是CGGN6CCG 或CGGN11CCG。如转录因子Leu3p(参与亮氨酸代谢的调节)和Ppr1p（参与嘧啶代谢的调节）所辨认结合的2个CGG的间距分别为4 bp和6 bp［6］，按照CGG三联体的排列方向，这些DNA序列可被分为反向重复（inverted repeat）、翻转重复(everted repeat)和正向重复(direct repeat)3种类型，如图1所示（其中Hap1参与细胞色素C表达的调节）。二聚体Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白与DNA序列相互作用的方式如图2所示。Gal4p识别位点: CGGAAGACTCTCCTCCG Ppr1p识别位点: TCTTCGGCAATTGCCGAAGA
反向重复 GCCTTCTGAGAGGAGGC 反向重复 AGAAGCCGTTAACGGCTTCT
Leu3P识别位点： TGCCGGTACCGGCTTGG Hap1识别位点：GCCGGGGTTTACGGACGATGA
翻转重复 ACGGCCATGGCCGAACC 正向重复 CGGCCCCAAATGCCTGCTACT
图1 部分锌簇蛋白识别的DNA序列，图框中是CGG三联体［6］（略）
Figure 1 Zinc cluster proteins preferentially recognize CGG triplets
图2 锌簇蛋白与DNA序列的结合方式［5，6］（略）
Figure 2 Model for DNA binding of Zinc cluster proteins
矩形代表二聚体相互作用区域，箭头部分代表与DNA相互作用的区域，指明CGG的方向，矩形与箭头之间是连接区。
2 酿酒酵母中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
酿酒酵母的全基因组测序表明其含有54个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白。通过对其中33个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白功能的分析发现，它们多参与氨基酸代谢、多药耐药性、减数分裂等过程的调节。
2.1 与多药耐药性相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
酵母中的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白主要通过激活与多药耐药性（PDR，pleiotropic drug resistance）相关的ABC转运蛋白（ATPbinding cassette transporter protein）的表达而使酵母产生抗药性。这些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白现已发现十几种［7］，可结合于多药耐药性相关基因（PDR基因）的多药耐药性反应元件（PDREs），这些多药耐药性相关基因已发现有近十种，在这些基因的启动子中常有1到几个PDREs，标准序列为TCCGCGGA。多种Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白可以结合于同一基因的PDREs，同一个锌簇蛋白因子往往也可以调节多个PDR基因，这些Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇转录因子可以单独或协同调节PDR基因的转录起始过程，多以同源或异源二聚体的方式作用。这些调节作用多数是正调节作用，促进PDR基因的表达，也有一些起到负调节作用，调节方式及锌簇蛋白的相互作用的关系复杂多样。如Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Pdr1p、Pdr3p和Yrr1p都可激活ABC转运蛋白家族的PDR1基因的表达，它们辨认结合的PDREs序列互有重叠。Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Rdr1p是PDR基因的负性调控因子，△rdr1突变体可抗放线菌酮［8］，而其所结合的PDREs也正是Pdr1p/Pdr3p等的结合位点。ABC转运蛋白家族的PDR12可以在弱酸环境下从细胞中泵出安息香酸和山梨酸，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白War1p可诱导PDR12的表达［9］，在山梨酸胁迫下，War1p可迅速磷酸化并形成同源二聚体，结合于PDR12的启动子区域的酸性反应元件WARE，War1p的磷酸化与PDR12的转录激活几乎是同时发生的。
酵母还可以通过调节其麦角固醇的生物合成途径来产生抗药性。麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成成分，当其合成被激活时有利于使酵母产生抗药性，目前认为PDR途径、麦角固醇途径和鞘脂的合成途径等均有相互联系，共同促成酵母细胞的抗药性，麦角固醇和鞘脂及细胞质膜中的其它脂类可形成脂筏（lipid rafts），帮助从细胞中排出药物［10］。至少有11种ERG（ergosterol）基因编码麦角固醇合成相关酶类，它们都含有甾体反应元件。Upc2p和Ecm22p是2个高度同源的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白，有45%的氨基酸相同，有高度相似的DBD及羧基末端的激活域。在细胞中麦角固醇含量低时，它们可通过结合于相同的调控元件来激活ERG2和ERG3基因的转录。△upc2和△ecm22的突变体则不会出现以上的激活作用，使酵母在一些环境中无法存活，如△upc2对抗真菌的吡咯类药物酮康唑敏感，△ecm22对放线菌酮敏感［11］。
2.2 酵母中与氨基酸代谢及减数分裂相关的Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白
酵母中有多个Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白参与氨基酸代谢的调节。如ARO9基因编码芳香族氨基酸的转氨酶，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Aro80p通过调控ARO9基因来参与调控芳香族氨基酸的分解代谢，当氨充足时，此基因表达被抑制，当芳香族氨基酸充足时，表达被激活，Aro80p结合于ARO9基因上游-168 bp至-133 bp处的序列，这段序列长32 bp，含有5组CGG三联体序列，从而激活ARO9基因的表达［12］。
二倍体的酵母细胞在葡萄糖及氮缺乏时进行减数分裂，形成孢子。在这个过程中，UME6基因可诱导早期减数分裂相关的多个基因的表达。这些基因启动子区都含有URS1序列［13］，Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白Ume6可结合于相关基因前方的URS1区域。当此因子缺失时，可显著减少对减数分裂相关基因的诱导，使减数分离过程出现缺陷。