盾叶薯蓣辐射株系抗氧化酶活性及薯蓣皂苷元含量分析

               作者：谢彩侠1，祝侠丽， 高山林，白雨， 白雁

【摘要】  目的提高盾叶薯蓣药材的品质。方法通过组织培养，对辐射诱变获得的盾叶薯蓣株系进行了抗氧化酶活性及薯蓣皂苷元含量分析。结果经诱变获得的株系SOD、POD比活力和APX活性与对照株系相比差异很大，大部分辐射诱变株系薯蓣皂苷元含量都超过了对照株系，但试管苗与一年生苗薯蓣皂苷元含量相关性不明显。结论 经诱导获得的辐射诱变株系在清除活性氧能力及有效成分含量方面与对照表现出明显差异，说明辐射诱变可以作为盾叶薯蓣优良品种选育的途径。

【关键词】  盾叶薯蓣; 辐射诱变; 抗氧化酶活性; 薯蓣皂苷元

　盾叶薯蓣D. zingibiernsis C.H.Wright.属薯蓣科薯蓣属根状茎，又名黄姜、火头根，其根茎内薯蓣皂素的含量一般为2%左右，是目前世界上最好的激素类药源植物。同时具有清肺止咳、利湿通淋、通络止痛、解毒消肿的功能，可治肺热咳嗽、湿热淋痛、风湿腰痛、痈肿恶疮、跌打扭伤、蜂螯虫咬;其水溶性甾体皂苷成分对心肌缺血、胸痹、高脂血症等有明显治疗作用。

　　盾叶薯蓣是我国特有资源植物，是世界上薯蓣皂素含量最高的种类，最高单株达到16.5%，超过了世界王牌-墨西哥小穗花薯蓣15%的纪录。据调查我国10个省市都有盾叶薯蓣分布，其中湖北、湖南、陕西、四川分布最为集中，目前在陕西安康地区、湖北郧西地区、湖南安化地区、河南南阳地区都有一定规模的种植面积。实现人工栽培后，虽然解决了皂素供应问题，而原料依旧短缺，主要原因是产量低、皂素含量变化较大，质量难以控制。因此有必要进行品种选育和提纯复壮的工作。

　　细胞在正常代谢活动中和在不利的环境条件下均能产生活性氧。生物体经过长期进化形成了完善和复杂的抗氧化保护系统来清除活性氧。但当产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力时，就会产生氧化损伤，导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链断裂和蛋白质损伤。因此，植物中清除活性氧能力的相关酶含量和活性的测定和筛选，在优良品种选育中具有重要参考价值。鉴于此，笔者利用组织培养技术进行了盾叶薯蓣辐射诱变育种，并对诱变株系叶片中超氧化物歧化酶(SOD)，抗坏血酸过氧化物酶(APX)，过氧化物酶(POD)3种抗氧化酶的活性及薯蓣皂苷元含量进行了分析，为盾叶薯蓣优良株系的选育提供依据。

　　1 材料与仪器与方法

　　1.1 材料盾叶薯蓣愈伤组织在MS+BA0.05 mg/L+PP333 0.5 mg/L培养基上分化的丛生牙作为幅射材料。

　　1.2 仪器和试剂BECKMAN DU-600分光光度计，水浴锅，微量加样器。酶提取液： pH 7.5的0.05 M 的Tris-HCl缓冲液，PBS pH(7.0)，0.1mmol/L EDTA， 0.1 mmol/L H2O2， 0.5 mmol/LASA，丙酮，SOD试剂盒(购于建成生物试剂研究所)。2 方法

　　2.1 辐照株系的建立用不同剂量的钴60辐照盾叶薯蓣的丛生芽，30 d后统计存活率，对存活芽进行扩大繁殖，并淘汰长势较弱，生长畸形的植株。

　　2.2 SOD，POD，APX活性的测定精密称取生长30 d的辐照株系与未辐照株系试管苗新鲜叶片1.0 g，每份材料加5 ml预冷的提取缓冲液(pH7.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液)及少量石英砂，置于冰浴中研磨后，4 ℃冷冻离心机6 000 r/min离心10 min，上清液即为酶提取液。SOD活性按试剂盒说明书操作。POD总活力按文献[1]的方法进行，酶的比活力用ΔOD470/ (mg·min)(protein)表示。APX活性参照文献[1]的方法，酶活单位定义为每小时氧化μmol ASA的酶量为一个酶活单位。

　　2.3 盾叶薯蓣试管苗薯蓣皂苷元含量分析[2，3]盾叶薯蓣试管苗在MS/2+IAA0.2 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待苗长至30～35 d左右，洗净根上的培养基，将根剪掉，在60 ℃下烘干，粉碎，过60目筛，供含量分析用。

　　2.3.1 薯蓣皂苷元的测定供试品溶液制备：精密称取盾叶薯蓣粉末0.7～1.0 g，置于三角瓶中，加2.0 mol/L的硫酸50 ml，在100℃水浴锅中水解4 h，放冷过滤，药渣用蒸馏水洗至中性，60 ℃干燥后，用石油醚(60～90℃)50 ml在90℃水浴中索氏提取5 h，提取液回收至干后用无水乙醇溶解，过滤至5 ml的容量瓶中，用无水乙醇定容待测定。对照品溶液制备：准确称取薯蓣皂苷元标样0.001 g，置2 ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，稀释至刻度，得0.5 μg/μl的标准溶液备用。

　　2.3.2 色谱条件选择仪器：Agilent 1100 Series

　　分析条件：Microsorb-MV100 C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm )。无水甲醇为流动相，进样量20 μl，流速0.5 ml/min，检测波长203 nm, 柱温为室温。样品中薯蓣皂苷元与其它成分达到良好分离(见图1～2)。样品含量测定：以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。

　　2.3.3 样品含量测定以上述色谱条件对盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量进行分析，并计算其含量。

　　2.4 盾叶薯蓣部分辐射诱变株系一年生苗薯蓣皂苷元含量分析将辐射诱变株系试管苗在其试管苗在MS/2+IAA0.2 mg/L+ NAA0.2 mg/L培养基上诱导生根，待根长至3～4 cm左右将试管苗移出培养室。在室温下开瓶加入少量水保湿，炼苗1～2 d。将试管苗取出，小心洗去苗上的培养基。傍晚时分，将苗栽入以蛭石和复合肥为基质的苗床中，每日中午喷雾2 h保湿，30 d后移栽到大田中，使其在自然条件下生长1年，挖取地下根茎, 去除泥沙、切片、在60℃干燥至恒重，粉碎过60目筛, 供含量分析用。由于盾叶薯蓣试管苗移栽成活率较低，导致一年生辐射诱变各株系材料有限，因此我们仅对5个株系进行了薯蓣皂苷元含量进行了分析。测定方法除样品量为0.2～0.3 g外，其他同“2.3”。图1 薯蓣皂苷元对照品的RP-HPLC图谱 1为薯蓣皂苷元峰图2 盾叶薯蓣样品的RP-HPLC图谱 1为薯蓣皂苷元峰