异黄酮NO供体衍生物的合成及其初步生物活性

　　2.5 7-[(3-硝基氧基)丙氧基]-4’-甲氧基异黄酮(6b)的合成将硝酸银6.0 g(0.035 mol)溶于无水乙腈20 ml中，磁力搅拌，避光加热至50℃，迅速加入7-溴丙氧基-4’-甲氧基异黄酮2.4 g(0.006 2 mol)和无水乙腈55ml的混合液。加毕继续加热至70℃，反应2.5 h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入醋酸乙酯和水，分出有机层，用醋酸乙酯(20ml×3)萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却，得到白色结晶4.7 g, 收率为76.6%，m.p.121.2～121.5℃; IR (KBr) υ: 3 451, 2 926, 1 627, 1 514, 1 444, 1 279, 1 259, 1 180, 1 034, 888, 829; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz))δ: 2.31 (2H, t, -CH2-CH2-CH2), 3.87 (3H, s, -O-CH3), 4.12 (2H , t , -CH2-ONO2), 4.73 (2H , t , -O-CH2-), 6.87～8.25 (8H, m, Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)δ: 26.9， 29.7, 55.4, 64.2, 69.6, 100.8,114.0, 114.6, 118.8, 124.2, 125.0, 128.0, 130.1, 152.1, 157.8, 159.6, 162.7, 175.8; MS m/z+ 371.9。

　　3 初步活性实验[8，9]

　　3.1 目标化合物NO 释放量的测定将目标产物及对照化合物单硝酸异山梨醇酯溶于二甲基亚砜中(0.01 mol/ L) ,再用磷酸缓冲液稀释。缓冲液里含有过量的半胱氨酸(5 mmol/ L) ,混匀,受试物终浓度为10- 4 mol/ L 。将溶液置于37 ℃环境中孵化, 于不同时间点取反应液8 ml与格里斯试剂2 ml混合在锥形瓶中，试剂混合,室温放置10 min ,于540 nm 处测吸收度。NO 释放量以其氧化物亚硝酸盐(NO2-)的量表示。结果如图2所示，合成的两个一氧化氮供体化合物在2 h内，释放一氧化氮明显，均达到40%Cmax以上水平，高于单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量3倍左右;2 h后，释放趋于平缓。单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量低，具有释放缓慢增多的趋势。在3 h内，6a、6b和单硝酸异山梨醇酯的Cmax分别为0.25、0.195、0.122。这3个化合物的NO释放量顺序是6a >6b >>单硝酸异山梨醇酯。图2 NO的体外释放

　　3.2 体外抗肿瘤活性实验用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将人淋巴样白血病细胞HL-60稀释成5 × 104个/ml的细胞悬液，取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置于恒温CO2培养箱中培养24 h。然后分别加入化合物4、6a和6b20 μl/孔，每档浓度设4 个平行孔，另设溶剂对照组, 培养48 h。加入MTT，再培养4 h后吸去上清液，各孔加150 μl DMSO，轻轻振荡5 min后用酶联免疫检测仪在标波长为490 nm处测定各孔的吸光度( A) 值，并计算细胞的抑制率。从图3可以看出，化合物4、6a和6b在10～100 μg/ml的浓度下，三者均表现出了抑制人淋巴样白血病细胞HL-60增殖的作用，而且这种作用呈剂量依赖性，同时还可以看出，异黄酮与一氧化氮供体偶联物6a和6b的细胞抑制率与母体异黄酮4相比有了明显的提高，可能是因为6a和6b释放出NO与母体产生协同作用，增强了抑制肿瘤细胞增殖活性。图3 目标产物对HL-60细胞的抑制作用

　　4 讨论

　　由7-羟基-4’-甲氧基异黄酮4制备5a和5b的反应是属于分子亲核取代反应加入少量的KI作为催化剂加快反应速率，因为I-既是强的亲核试剂又是很好的离去基团，先利用它取代二溴乙烷或二溴丙烷中的一个溴形成1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷，然后7-OH容易取代取代1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷中的碘生成5a或5b。同时加入的无水碳酸钾作为缚酸剂，可以及时除去生成的酸性物质。利用5a和5b与硝酸银避光下合成NO供体型异黄酮类衍生物，主要目的是为了防止硝酸银见光分解使得副产物增加。谱图分析：5a和5b的1H NMR谱大部分相差不大，只是5b比5a在化学位移2.4处多两个氢，这是5b比5a多一个亚甲基缘故。6a与5a 相比，由于硝基氧基取代了溴，导致原来与溴相连的亚甲基上的氢向低场移动，化学位移从3.72 ppm增为4.12 ppm，同样6a和6b的氢谱也有类似的变化。目标产物的红外光谱中，在1 650cm-1附近都有羰基特征峰。初步研究表明，调节连接碳链的长度，能够控制NO的释放速率，将具有释放一氧化氮活性的硝酸酯与异黄酮偶联，在一定程度上提高了抑制人淋巴样白血病细胞HL- 60增殖活性，可能是因为NO供体新异黄酮在人淋巴样白血病细胞HL-60内释放出异黄酮和NO，两者产生协同效应，导致了抗肿瘤作用增强。

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