六味地黄丸增强黑色素瘤自杀基因系统旁观者效应的体外研究
来源：岁月联盟
时间：2017-03-19
23对照血清与含药血清对B16细胞生长的影响含药血清孵育前,倒置显微镜下观察各组细胞生长状态良好,细胞形态与数目无明显差异,添加相应血清后48 h镜下观察细胞贴壁稳定,细胞密度高,生长旺盛,含药血清组细胞数目多于10%新生牛血清组与10%对照血清组。MTT法检测结果见表1,10%对照血清组与10%新生牛血清组对细胞作用比较差异无显著性意义(P>005),而六味地黄丸含药血清各组对细胞有增殖作用(均P<001)。
24各组对B16细胞株HSVtk/GCV系统增效作用量效关系的检测结果MTT法分析各组的抑制率见表2,含药血清联合GCV各浓度组的实际抑制率明显高于相应浓度的理论抑制率,金正钧Q值分别为128、154、174,均大于115,具有协同增效作用。表1各组对B16细胞生长的影响(MTT检测)表2各组对B16细胞株HSVtk/GCV系统
3讨论
黑色素瘤是表皮基底黑色素细胞发生的恶性肿瘤,好发于头颈部,其恶性程度高,容易复发和转移,预后差。临床治疗以手术切除为主,放疗化疗效果差[5],基因治疗尤其是自杀基因疗法给黑色素瘤患者带来了希望。自杀基因疗法即将自杀基因导入肿瘤细胞中,其基因表达产物可选择性地将低毒或无毒的前体药物代谢成有毒代谢产物,这些有毒代谢产物通过干扰细胞DNA正常合成而使细胞死亡[6]。自杀基因疗法有一个突出的优点“旁观者效应”(bystander effect),即导入自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞具有杀伤作用,近年来备受关注[7]。Bonnekoh等[8]在黑色素瘤自杀基因治疗的模型研究中发现,肿瘤体积减少的程度(80%)与转导效率推测的程度不成比例,考虑到可能是通过旁观者效应杀伤未导入基因的邻近分裂细胞,提高旁观者效应。
HSV1tk/GCV系统是最常用的自杀基因治疗系统,旁观者效应的有无关系到HSV1tk/GCV系统治疗的成败,除极少数细胞株未发现旁观者效应外,绝大多数细胞株均有旁观者效应。不同细胞对该系统敏感性的差异,很大程度上与旁观者效应的强弱有直接关系。如图4(彩图见第557页)示低浓度(625 μmol/L)的GCV能杀伤70%以上的100%B16/tk细胞,提示B16/tk具有生物活性,B16细胞株对GCV敏感。但是转染效率低下却是临床上应用基因治疗面临的主要难题,在tk转染低效率的情况下能获得较强的旁观者效应将为自杀基因的应用带来更广阔的前景。
为了更好地观察六味地黄丸对旁观者效应的增效作用,我们将B16/tk与B16细胞以不同比例混合后检测其对GCV的敏感性,发现B16/tk所占比例在40%及以上时低浓度的GCV(625 μmol/L)即可发挥极强的旁观者效应,联合杀伤时中药没有发挥药效的空间;而B16/tk所占比例在10%时高浓度GCV(200 μmol/L)也未能显示出明显的杀伤效应,可能是10%B16/tk组tk+比例太低,旁观者效应太弱,另外考虑到B16/tk系统构建时G418筛选后得到的tk+克隆并非单细胞克隆,即实际混合的10%B16/tk可能并未达到10%tk+,也可能是其未能观察到旁观者效应的原因之一;20%B16/tk在GCV浓度为25 μmol/L时对细胞生长的抑制率为349%,能观察到一定的旁观者效应,并且还有足够的杀伤空间,故此六味地黄丸和自杀基因联合杀伤药效学实验选用20%B16/tk的混合细胞。
本研究中采用的中药血清药理学方法不仅能反映中药及其代谢产物的药理作用,而且能反映可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用,更接近药物在体内环境产生的真实过程,对中药复方的药理学研究具有明显优势。前期研究表明：大鼠血清本身对恶性黑色素瘤B16细胞有一定促生长作用,血清浓度在10%以内时细胞生长状态较好,随血清浓度的增高细胞状态变差。借鉴此结果,本实验选择体积分数25%、5%、10%的含药血清作为工作浓度。无论是细胞培养用牛血清还是含药血清,其成分复杂,为了减少实验中的影响因素,本研究在前期工作的基础上加以改进。在细胞无血清培养的基础上添加含药血清,用对照血清作为对照组,含药血清采用10%总体积,为了排除大鼠血清本身对细胞的影响,药物血清不足10%者,用大鼠对照血清补足体积。
本实验结果显示：与单独自杀基因组(加对照血清)或单独含药血清组比较,联合用药明显提高了对恶性黑色素瘤细胞的旁观者效应,差异均有显著性意义(P<001),协同性分析显示联合用药组对恶性黑色素瘤细胞的杀伤作用是一种协同效应(Q>115),这种协同效应可能源于旁观者效应。旁观者效应的可能机制有缝隙连接机制、免疫介导机制、细胞凋亡机制、介质机制等。体外实验无免疫介导机制,可见六味地黄丸可能通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制介导旁观者效应,达到协同增效作用,具体如何调节细胞缝隙连接通讯或细胞周期与凋亡从而增强旁观者效应还有待于进一步深入研究。
【参考文献】
[1]任涛,李枚娟,颜江华.自杀基因治疗恶性肿瘤的研究现状及展望[J].现代肿瘤医学,2009,17(12)：2435.
[2] Klatzmann D, Cherin P, Bensimon G, et al. A phase I/II doseescalation study of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase“suicide”gene therapy for metastatic melanoma. Study Group on Gene Therapy of Metastatic Melanoma[J]. Hum Gene Ther, 1998, 9(17): 2585.
[3] 杜标炎, 袁静, 谭宇蕙, 等. 六味地黄丸对自杀基因系统治疗黑色素瘤的增效作用[J]. 广州中医药大学学报, 2006, 23(5): 397.
[4] 金正均.合并用药中的相加[J].中国药理学报,1980,1(1)：70.
[5] 崔正军, 岑瑛. 恶性黑色素瘤基因治疗的研究现状[J]. 华西医学, 2004, 19(3): 513.
[6] Yazawa K,Fisher W E,Brunieardi F C,et a1.Current progress in suicide gene therapy for cancer[J].World J Surg,2002,26(7)：783.
[7]任涛,李枚娟,颜江华.自杀基因治疗恶性肿瘤的研究现状及展望[J].现代肿瘤医学,2009,17(12)：2435.
[8] Bonnekoh B, Greenhalgh D A, Chen S H, et al.Adenovirusmediated ex vivo immunogene and in vivo combination gene therapy strategies induce a systemic antitumor immune defense in the mouse B16 melanoma model [J].Adv Exp Med Biol, 1998, 451：335.
