人结肠癌总RNA转染树突状细胞介导个体化免疫治疗的体外实验

来源:岁月联盟 作者: 时间:2017-03-19

                                 作者:王绛辉 李雪敏 许士珍 刘巧格

【摘 要】  目的 探讨转染自体肿瘤细胞总RNA的树突状细胞体外所介导的抗结肠癌免疫效应。方法 制备短期培养的原代结肠癌细胞。用rhGM-CSF 、rhIL-4和TNF-α体外诱导结肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)的DC发育和成熟,转染自体肿瘤细胞总RNA,激活自体T 细胞产生CTL。应用流式细胞技术及混合淋巴细胞培养法检测DC的免疫功能状态;用CCK-8试剂盒检测活化CTL的杀伤活性;应用ELISA 测定IL_12和INF_γ的分泌水平。结果 转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC不仅高表达MHC_I、MHC_II类分子及CD80、CD83、CD86共刺激分子,并获得高效刺激自体或异体T淋巴细胞增殖的能力;转染RNA后成熟DC分泌IL_12水平以及其刺激产生的CTL上清液中INF_γ的浓度显著高于单纯成熟DC及未成熟DC;且CTL对自体结肠癌细胞杀伤率显著高于异体组。结论 转染自体结肠癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性及杀伤活性的CTL。
【关键词】 结肠癌 树突状细胞 细胞毒性T淋巴细胞 免疫治疗
项目来源:河北省中医药管理局科学研究计划项目(项目编号:2008108)。  ②作者简介:王绛辉(1970年- ),男, 主治中医师,主要从事中医临床研究。

        肿瘤的生物治疗近年来发展迅速。树突状细胞( DC) 作为体内专职抗原提呈细胞(APC)在机体抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用[1,2]。研究表明,肿瘤细胞RNA转染DC可诱导抗肿瘤免疫反应[3],但其作用机理尚不明确。我们通过观察转染结肠癌患者自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC对免疫功能的调节作用,及抗原特异性CTL对原代培养的自体/异体肿瘤细胞杀伤效率的比较,进一步明确其作用机制,为临床开展个体化抗肿瘤免疫治疗提供依据。
        1 材料与方法
        1.1 试剂 :RPMI1640培养基 (GIBCO公司);IL_12、INF_γEL ISA检测用试剂盒、重组人白介素_4(rhIL_4)、重组人粒单细胞集落刺激因子( rhGM-CSF)和TNF_α均购自英国PeproTech EC Ltd公司;淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(Pharmacia, Sweden);Cell Counting Kit_8 (CCK_8 Kit)购自日本同仁株式会社。
        1.2 自体原代肿瘤细胞培养: 短期培养的自体原代肿瘤细胞系WMCC1003、WMCC1004和WMCC1005分别来自3例男性结肠腺粘液腺癌患者(均行根治性结肠切除术)。依据文献[4]的方法筛选原代细胞系。
        1.3 自体肿瘤细胞总RNA的准备 :取患者自体手术切除新鲜肿瘤标本200mg,按Run-out 试剂盒使用说明常规提取RNA,分光光度仪测定0D260/0D280nm比值大于1.8,计算RNA总量并调整浓度为2.5g/L。经1%琼脂糖凝胶电泳见28S及18S两条带清晰完整。
        1.4 提取和培养自体DC: 取患者外周抗凝血,PBS等倍稀释后移入预加Ficoll-Hypaque分离液的离心管中,1500转/min离心20min;取上层血浆0.22um滤膜过滤后备用;吸取单个核细胞, 用含2mM EDTA的PBS洗涤3 遍,移入塑料培养瓶中,加入含5%自体血浆的RPMI 1640培养基静置培养2 h,分离未贴壁细胞继续培养,贴壁细胞消化后以1×106/ ml接种于6 孔培养板;分别于3d、5d换液,第5d时将细胞分为两部分,一部分加入TNF_α10ng/ml,48h后收集呈悬浮细胞为成熟树突状细胞(mDC),收集另一部分未加TNF_α的细胞作为未成熟树突状细胞(imDC)                                                          
        1.5 自体T淋巴细胞分离 用miniMACS磁珠分选仪及Human Pan T Cell Isolation Kit,按试剂盒所示方法从非贴壁PBMC中分选自体T细胞,并用流式细胞仪检测FITC标记的CD3,鉴定T细胞的纯度。
        1.6 自体肿瘤细胞总RNA转染DC  在培养5d的DC(1×106/ ml)中以25 g/ L的浓度加入自体肿瘤细胞总RNA ,经7d培养成已转染自体肿瘤RNA的mDC(RNA_mDC)。
        1.7 用RNA_mDC诱导产生CTL 参照Shirley等方法并稍作改进[5]。将磁珠分离的自体T淋巴细胞等分为三组分别与imDC、mDC和RNA—mDC以40:1比例混合培养,收集CTL检测其对自体或异体原代结肠癌细胞的细胞毒性。
        1.8 DC细胞流式检测 :分别收集imDC、mDC和RNA-mDC,调整细胞浓度为1.2×106/ml,分别依次加入20%封闭用兔血清、标有荧光素的不同单克隆抗体工作液,避光静置后各加入PBS 100ul混匀后上机检测。
        1.9 淋巴细胞增殖实验(MLR) :取imDC、mDC和RNA-mDC与自体/异体T按 E:T= 5:1、10:1、20:1和80:1的比例混合后加入96 孔培养板,每样本各设各3个复孔。37℃孵育96h,加入CCK-8试剂(20μl/孔)[6],继续孵育3 h 后,用酶标仪在450nm波长测定各实验孔OD值。
        1.10 CTL活性检测 :imDC、mDC和RNA-mDC诱导产生的CTL分别同自体和异体原代培养的结肠癌细胞按E:T= 40:1、20:1 和10:1 的比例混合加入96 孔培养板,每样本各设3个复孔。37℃孵育18h,加入CCK-8试剂(20μl/孔),继续孵育3 h 后,用酶标仪在450nm波长测定实验孔OD值,计算杀伤率。 
杀伤率(%)=(1-〖SX(〗实验组0D值—单纯效应细胞组0D值)单纯靶细胞0D值〖SX)〗)×100% 
        1.11 细胞因子检测:取imDC、mDC和RNA—mDC组的培养上清液和各组DC诱导刺激产生的CTL上清液,按ELISA 检测试剂盒操作说明检测各DC组中IL_12和各CTL组中INF_γ的含量。
        1.12 统计学方法 :所有数据采用均值±标准差表示,经SPSS 统计软件处理,两组比较用配对t 检验,三组及三组以上的两两比较用单因素方差分析,P<0.05 差异有统计学意义。  
        2  结果
        2.1 原代培养肿瘤细胞的形态学观察:   原代培养的结肠癌细胞镜下观察呈梭形、片状或多角形单层细胞,由组织块向周围呈放射状生长。经PAS特殊染色70%以上的细胞呈阳性反应。 

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