胃痞消对脾虚型慢性萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞增殖周

来源：岁月联盟 作者：潘华峰 任金玲 赵自 时间：2017-03-19
　　【摘要】 【目的】观察健脾化瘀解毒中药胃痞消(由黄芪、太子参、白术、丹参、白花蛇舌草等组成)对脾虚型慢性萎缩性胃炎(CAG)癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞的增殖周期分布及凋亡基因表达的影响。【方法】选用SD大鼠，随机分为6组，即正常对照组，模型组，胃痞消高、中、低剂量组(剂量分别为15、75、375 g·kg-1·d-1)，维酶素组(剂量为027 g·kg-1·d-1)。除正常对照组外，其他组均采用N甲基N′硝基N亚硝基胍(MNNG)液自由饮用结合饥饱失常加耗气泻下法复制脾虚型CAG胃癌前病变模型,观察胃痞消各剂量组连续治疗4周后对大鼠胃黏膜上皮细胞增殖周期分布、凋亡率、凋亡基因p53、Bcl2和Bax表达的影响。【结果】胃痞消各剂量组可显著增加胃黏膜上皮细胞凋亡率，增加G0/G1期、减少S期细胞分布,促进p53表达,抑制Bcl2表达(均P<001),胃痞消高剂量组可显著促进Bax表达(P<005)。【结论】胃痞消可抑制CAG癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞的增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与其能促进p53和Bax表达,抑制Bcl2表达有关。
　　【关键词】 胃痞消/药理学;癌前状态/中药疗法;胃肿瘤;细胞周期;基因表达调控;疾病模型，动物;大鼠
　　胃癌同其他肿瘤一样,很少从正常组织发生癌变,单纯的慢性萎缩性胃炎(CAG)与胃癌的发生可能无直接关系,而在CAG基础上发生的肠上皮化生及异型增生,则是胃癌发生的组织学基础[1]。因此CAG胃癌前病变(PLGC)大鼠模型均采用长期CAG法进行复制。本文拟通过观察健脾化瘀解毒中药胃痞消对脾虚型CAG模型大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡和增殖周期分布,以及凋亡基因表达的影响,探讨中药逆转CAG并阻断CAG癌变的分子机制,现报道如下。
　　1材料与方法
　　11实验动物SPF级SD大鼠77只, 体质量60～80 g,雌雄各半,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(粤)20030001;饲养及实验环境：广州中医药大学实验动物中心SPF实验室,实验环境合格证号：0008252。
　　12药品、试剂及仪器N甲基N′硝基N亚硝基胍(MNNG)由日本东京株氏会社提供,藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标记抗大鼠p53单克隆抗体、PE标记大抗鼠Bax单克隆抗体均为美国Dako公司产品,PE标记抗大鼠Bcl2单克隆抗体为美国Zymed公司产品,PE标记的二抗羊抗鼠异硫氰酸荧光素标记IgG抗体(FITCIgG)为美国Sigma公司产品。胃痞消(由黄芪、太子参、白术、丹参、白花蛇舌草等组成)由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供并鉴定,维酶素由张家港制药厂生产(批号：国药准字H46020296)。Facstarplus型流式细胞仪为美国 Becton Dickinson公司产品。
　　13分组及脾虚型CAG模型复制将大鼠随机分为正常对照组(10只)，模型组(15只)，维酶素组(13只，剂量为027 g·kg-1·d-1,1倍成人临床等效剂量[2],下同)，胃痞消高剂量组(13只,剂量为15 g·kg-1·d-1,2倍成人临床等效剂量)、中剂量组(13只,剂量为75 g·kg-1·d-1,1倍成人临床等效剂量)和低剂量组(13只,剂量为375 g·kg-1·d-1,05倍成人临床等效剂量)。除正常对照组予以正常饮食外，其他组均采用MNNG液自由饮用法[3]复制CAG大鼠模型：先用灭菌自来水将MNNG配制成10 g/mL浓度的储存液,避光冷藏保存,临用时将其配成150 μg/mL的饮用液,装入200 mL的饮水瓶中,外贴黑色避光纸,整个配制过程全部避光操作。在此基础上结合经典的饥饱失常加耗气泻下法复制脾虚证[4],连续12周。
　　14给药方法于实验第8周末,从模型组中随机取2只大鼠,取胃组织,常规苏木素—伊红(HE)染色,光镜下观察到2只大鼠均有胃黏膜萎缩性病变,确认模型复制成功后,所有治疗组于第9周开始灌胃给药,正常对照组和模型组均灌服等容积灭菌自来水,1次/d,连续4周。于第12周末,禁食禁水12 h后处死,取外周抗凝血10 mL,-80℃保存备用。
　　15单细胞悬液的制备取新鲜胃黏膜组织约4 g,除去表面黏液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,尽量洗尽组织中的血液,在平面皿上剪成肉糜状,置300目铜网一边用眼科镊手背侧轻轻摩擦组织于铜网表面,一边将PBS洗搓下的细胞放入试管内,在37℃、体积分数5%CO2、95%相对湿度下孵育4 h。在4℃、1 500 r/min条件下离心7 min,弃上清液,重复2次,调整细胞数为1×106/mL,制成单细胞悬液。
　　16诱导胃癌前病变组织细胞凋亡实验将上述制备的单细胞悬液,用体积分数70%乙醇固定,进行流式细胞仪分析,上机前离心去除固定液,采用溴化乙啶(Ethidium Bromide,EB)一步插入法,DNA定量荧光染色,染液含EB 10 μg/mL、核糖核酸酶(RNA酶)10 μg/mL和曲里通X100(Triton X100)10 mg/mL,每份样品细胞调至1×106/mL,4℃染色30 min后,用流式细胞仪进行检测,观察细胞周期分布。
　　17p53、Bcl2和Bax表达的检测采用间接荧光流式细胞术检测,取1 mL细胞悬液, 体积分数75%冷乙醇固定,过夜。PBS清洗2次,加单克隆抗体(McAb)p53(第一抗体)、McAbBcl2或McAbBax 1 μL,4℃反应45 min。PBS清洗2次,加第二抗体羊抗小鼠FITCIgG 50 μL(1∶200稀释),4℃反应45 min,PBS清洗2次。每组样品均设非特异对照,以PBS代替第一抗体,其余步骤同上。用流式细胞仪检测和分析,记录p53、Bcl2、Bax表达阳性细胞的百分率,减去非特异对照值,即为p53、Bcl2、Bax表达水平。
　　18统计学方法采用SPSS 150统计软件进行数据分析。数据均以(±s)表示,组间均值的比较采用单因素方差分析,方差齐时组间均值两两比较采用SNK法,方差不齐时组间均值两两比较采用Dunnett T3法，检验水平α=005。
　　2结果
　　21各组对脾虚型PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞增殖周期分布的影响表1结果显示：与正常对照组比较,模型组胃黏膜上皮细胞凋亡率显著降低(P<001)。与模型组比较,胃痞消各剂量组和维酶素组胃黏膜上皮细胞凋亡率均显著增加(P<001);与维酶素组比较，胃痞消各剂量组胃黏膜上皮细胞凋亡率均显著增加(P<001)。
　　与正常对照组比较，模型组G0/G1、G2+M期细胞百分率均显著降低(P<001),而S期细胞百分率则显著升高(P<001)。与模型组比较,胃痞消高、中、低剂量组G0/G1期细胞百分率显著增加(P<001),S期细胞百分率显著降低(均P<001),而胃痞消高、低剂量组G2+M期细胞百分率比较差异无显著性意义(P>005),胃痞消中剂量组则显著增加(P<005)。与维酶素组比较,胃痞消各剂量组G0/G1期细胞百分率显著增加(均P<001)，S期细胞百分率显著降低(均P<001),胃痞消高、低剂量组G2+M期细胞百分率显著减少(均P<001),而胃痞消中剂量组则差异无显著性意义(P>005)。表1各组脾虚型PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞增殖周期分布及凋亡率比较(±s) 
　　组别Np凋亡/%p增殖周期/%G0/G1期S期G2+M期正常对照组101022±2154572±0954720±1201012±151模型组13461±167①3281±125①6280±110①744±168①胃痞消高剂量组132122±242③④7199±168③④2260±170③④753±176④胃痞消中剂量组132063±250③④5960±132③④3219±210③④932±201②胃痞消低剂量组131684±235③④5410±109③④4175±160③④622±184④维酶素组131062±181③3750±114③5497±190③1064±166③①P<001，与正常对照组比较;②P<005,③P<001，与模型组比较;④P<001,与维酶素组比较
　　22各组对脾虚型PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞p53、Bcl2、Bax表达的影响表2结果显示：与正常对照组比较,模型组p53 和Bax表达显著减少(均P<001),而Bcl2表达显著增加(P<001)。与模型组比较,胃痞消高、中、低剂量组和维酶素组p53表达显著增加(均P<001),而Bcl2表达显著减少(均P<001),胃痞消高剂量组Bax表达显著增加(P<005),而胃痞消中、低剂量组Bax表达差异无显著性意义(均P>005)。表2各组脾虚型PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞p53、Bcl2、Bax表达比较(±s)
　　组别Np53Bcl2Bax正常对照组104752±5361144±3024232±1122模型组131236±439①2652±492①2855±961①胃痞消高剂量组133375±819③⑤1426±335③⑤4146±1220②④胃痞消中剂量组132794±627③④1688±345③④3663±1144胃痞消低剂量组132361±842③1959±328③3381±664维酶素组132082±768③2115±343③3127±548①P<001,与正常对照组比较;②P<005，③P<001,与模型组比较;④P<005,⑤P<001，与维酶素组比较
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