气阴双补法对干燥综合征小鼠的实验研究

来源:岁月联盟 作者:金桂兰,汪悦 时间:2017-02-28

【摘要】  目的研究气阴双补法对干燥综合征小鼠的作用。方法将60只Bacb/C小鼠,按体质量随机分为6组,每组10只,即正常组,模型组,羟氯喹组,增液布津汤小剂量组、中剂量组和大剂量组。对照组用羟氯喹片剂,观察体质量、摄食量、饮水量、唾液流量、脾指数及颌下腺病理形态学变化。结果增液布津汤能有效缓解口干、口腔烧灼感、眼干、眼异物感、鼻干等临床症状。实验室检查方面能增加唾液流量及泪流量,病理显示能抑制淋巴细胞浸润。结论运用气阴双补不仅能缓解干燥综合征小鼠临床症状,而且能纠正免疫紊乱,疗效优于对照组。

【关键词】  气阴双补; 干燥综合征; 小鼠

  Abstract:ObjectiveTo research the function of the method of nourishing both "qi" and blood on the mice having SS.MethodsPut the 60 Bacb/C mice into 6 groups according to their weight at random, there were 10 mice in each group.The groups included the normal group, the model group, the hydroxychloroquine group, the low, middle and high dose group using Zengye Bujin Decoction. We used hydroxychloroquine tablets on the mice in the control group and then observed the index weight, food intake, water intake, salivary flow rate, spleen index and the pathomorphology observation of submandibular gland.ResultsZengye Bujin Decoction could effectively relieve dry mouth, burning mouth sensation, dry eye, eye foreign body sensation, dry nose and some other clinical symptoms. The examination of lab showed it could increase salivary flow rate and tear flow rate. Pathology also showed it could restrain the infiltration of lymphocyte.ConclusionThe use of the method of nourishing both "qi" and blood can not only relieve the clinical symptoms of the mice having SS, but also correct immunologic derangement, whose efficacy is better than those in the control group.

  Key words:Nourishing both "qi" and blood ;  SS;  Mice;  Experimental research

    干燥综合征(Sjogren′s syndrome,SS)是一种侵犯外分泌腺体(尤以唾液腺和泪腺为主)的慢性自身免疫病。本病病因可能与遗传、免疫、性激素、内分泌和病毒感染等因素有关。中医学无此病名,根据其发病及临床特征,将之归属祖国医学“燥证”“燥痹”范畴。金元时期,刘河间在《素问玄机原病式·燥类》中指出:“诸涩枯涸,干则皴揭,皆属于燥”;并创立麦门冬饮子以治之。明清以后,各家对燥证已论述颇多,均从不同角度对燥证进行了较系统的探讨和研究。最具代表性的是清代喻嘉言,认为除燥伤于外皮肤皴揭之外,燥伤于内而致的精血枯涸亦属于燥证范畴,并根据刘河间“风热胜湿为燥”的理论提出了辛凉甘润法治疗燥证,代表方剂为著名的清燥救肺汤。然而,从临床研究发现,SS除与阴虚燥毒有关外,与气虚因素密切相关,运用气阴双补法对干燥综合征小鼠实验研究,通过研究其对小鼠的干预作用,旨在为临床治疗提供确切依据。

  1  材料与仪器

  1.1  动物12周龄Bacb/C小鼠,60只,18~22 g,雌性,由南京青龙山实验动物中心提供。

  1.2  药品增液布津汤,由南京中医药大学药学院制剂研究室提供;
   
  硫酸羟氯喹(hydroxychloroquine,HCQ),上海中西制药有限公司,批号:040501。

  1.3  试剂弗氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂,SIGMA,USA,Lot:075K8915;吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗,成都生物制品研究所,批号:200503171。PBS磷酸盐缓冲液,0.01M,pH7.2~7.4,中杉金桥,批号:ZLI9061;牛血清白蛋白,南京生兴生物技术有限公司,Amresco分装,Lot:1105S02;Mouse IFNγ ELISA KIT,晶美生物工程有限公司,Lot:FMK0003;Mouse IL4 ELISA KIT,晶美生物工程有限公司,Lot:FMK0005。

  1.4  仪器FA2104上皿电子天平,上海精科;XW80A涡旋混合器,上海医科大学仪器厂;Eppendorf 5417R高速低温冷冻离心机;LDZ52型离心机,北京医用离心机厂;FSHII型高速电动匀浆器,江苏金坛振华仪器厂;TU1800S紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;PYXDH540X50隔水式电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;TEB微量振荡器,姜堰市康泰医疗器械厂;BIORAD 3550酶标仪,MICROPALTE READER。

  2  方法

  2.1  分组及给药60只Bacb/C小鼠,按体重随机分为6组,每组10只。临用前分别将上述药物用生理盐水配成以下浓度:正常组:生理盐水10 ml/kg;模型组:生理盐水10 ml/kg;羟氯喹组:0.1 g/kg;增液布津汤小剂量组: 0.05 g/ kg;增液布津汤中剂量组:0.075 g/ kg;增液布津汤大剂量组:0.10 g/ kg。且小鼠灌胃体积为10 ml/kg。各组均在第0天即开始给药。

  2.2  抗原的制备取8只Bacb/C小鼠,脱颈椎处死,75%酒精浸泡10 min,在无菌操作台上解剖颈部,取出两侧颌下腺,分离包膜及结缔组织,用氯化钠注射液洗净,置无菌滤纸上吸干,称重,用显微剪剪碎,每0.1 g置入10 ml无菌试管中,加氯化钠注射液2 ml,在冰浴中用匀浆器以5 000 r/min匀浆20 s,4℃低温离心机中3 000 r/min离心20 min,弃去上层脂质,吸出上清液,置10 ml无菌试管中,以上操作均在低温下进行。

  2.3  Lowry法蛋白定量

  2.3.1  溶液配制溶液A:0.5 g CuSO4·H2O、1 g C4H4O6KNa·4H2O加重蒸水至100 ml;溶液B:2 g Na2CO3、0.4 g NaOH加重蒸水至100 ml;溶液C:1 ml溶液A加50 ml溶液B,混匀;溶液D:10 ml Folin酚试剂加10 ml重蒸水混匀。

  2.3.2  检测精密吸取样品溶液1 ml,加入5 ml溶液C,混匀,在室温下放置10 min,加0.5 ml溶液D,混匀,30 min后以分光光度计测定吸光值,检测波长为650 nm。

  2.3.3  标准曲线的制备分别精密吸取1.0 ml系列对照品溶液于具塞试管中,以1.0 ml蒸馏水作空白对照,Lowry法测定,用752紫外可见分光光度计在650 nm波长处测定吸收度。以牛血清蛋白对照品浓度(C)为横坐标,吸收度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,并根据标准曲线计算蛋白含量。

  2.4  SS小鼠模型的制备用灭菌PBS将抗原稀释成800 μg/ml,加等量弗氏完全佐剂,使抗原变为400 μg/ml的油水混合乳剂,第0天,模型组、羟氯喹组、大、中、小剂量组小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05 ml,即每只小鼠注射0.1 ml抗原。第14天,用弗氏不完全佐剂将抗原调整为400 μg/ml,小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05 ml。正常组小鼠注射0.1 ml PBS加佐剂。在第2天及第7天,各只小鼠腹腔注射0.05 ml白百破联合疫苗。

  2.5  检测指标

  2.5.1  小鼠体质量、摄食量、饮水量的测定每2天称小鼠体质量,每2天加饲料100 g,加水100 ml,2 d后称量剩余饲料量及水量,投入的饲料量或水量分别减去剩余饲料量或剩余水量即为每2天每笼小鼠摄食量及饮水量。

  2.5.2  小鼠唾液流量的测定每周测定每只小鼠唾液流量,测定前禁食1 h,不禁水。测定前做好棉球称干重,重量范围4.5~5.0 mg。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入实验小鼠口颊内,5 min后取出,电子天平上称湿重。

    唾液分泌量(mg)=湿重-干重

  2.5.3  脾指数、颌下腺指数的测定于实验结束,小鼠眼眶取血后脱颈椎处死,取血,3 000 r/min离心10 min,取血清用于细胞因子测定。取脾及颌下腺称重。

    脾指数=脾重量(g)÷小鼠体重(g)×1 000

    颌下腺指数=颌下腺重量(g)÷小鼠体重(g)×1 000

  2.5.4  小鼠外周血中T淋巴细胞亚群 检测小鼠眼眶取血后脱颈椎处死,取血,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群CD3+,CD4+,CD8+。

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