苜蓿总皂苷提取物抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂的作用
作者：邴飞虹 ，但汉雄，程静，韩俊，李婧，廖一帆
【摘要】 目的研究苜蓿总皂苷提取物抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂的作用。方法苜蓿总皂苷提取物组高、中、低剂量分别为0.7，0.35，0.18 g·kg-1，阳性组：绞股蓝总苷片56 mg·kg-1，模型组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予高脂饲料；对已造模的大鼠，按体重1.0 ml/100g灌胃，空白组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予普通饲料；1次/d，连续给药90 d。检查血脂相关指标、主动脉病变情况、主要脏器组织的情况。结果苜蓿总皂苷提取物使大鼠的血脂相关指标、主动脉病变情况、重要脏器组织病变情况有不同程度的改善。结论苜蓿总皂苷提取物有抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂的作用。
【关键词】 苜蓿总皂苷提取物； 大鼠； 动脉粥样硬化； 降血脂
苜蓿为豆科植物紫苜蓿Medicago sativa L.或南苜蓿Medicago hispida Gaertn.的全草，是多年生草本植物。苜蓿总皂苷提取物不仅对于高脂血症有治疗作用，因其毒性低微，还可作为中老年人长期使用的保健品。苜蓿提取物在防治血脂代谢紊乱和抗动脉粥样硬化方面有其独到之处。本实验主要进行苜蓿总皂苷提取物抗大鼠动脉粥样硬化和降血脂的作用研究，为该新药的临床试验提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 受试药物苜蓿总皂苷提取物，批号：060828，061010，由广东省中山市中健药物研究所有限公司提供。用蒸馏水配制成36%，25%，14%的溶液，分别作为高、中、低剂量组，4 ℃保存备用。
1.2 试剂绞股蓝总苷片，由广州白云山和记黄浦中药有限公司提供，批号：E6A003，规格：每片含绞股蓝总苷20 mg，药片粉碎后加蒸馏水配成所需浓度，4℃保存备用；丙硫氧嘧啶片，由上海复星朝晖药业有限公司提供，批号：070901，规格：每片含丙硫氧嘧啶50 mg；维生素D3注射液，由上海通用药业股份有限公司提供，批号：080401，规格：7.5 mg/ml。总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)测定试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒，批号分别为011M042、010M050，012L028，012L028，均由上海名典生物工程有限公司提供；TXB2、PG6-ket、ET放免分析药盒，批号分别为070820，070820，070820，均由北京北方生物技术研究所提供；胆固醇，由上海科瑞生物有限公司提供；戊巴比妥钠，由北京化学试剂公司提供，批号：20071019；吐温80，由天津市标准科技有限公司提供，批号：070706；丙二醇，由湖北大学化工厂提供，批号：930801；蛋黄乳液，称取鲜鸡蛋黄15g加生理盐水配成75%的乳液；食用猪油，由宜昌双汇食品有限责任公司提供。
1.3 仪器Spctrumlab 53 power紫外分光光度计，上海棱光技术有限公司产品。TB-718E组织自动包埋机，湖北泰维医疗科技有限公司提供。TC-120S组织自动脱水机，湖北泰维医疗科技有限公司提供。RM2135石蜡切片机，德国Leica公司产品。HM525冰冻切片机，德国Microm公司产品。GC-1200放射免疫计数器，中国科学技术大学科技实业总公司中佳光电仪器分公司生产。80-2B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂。电子精密天平，奥豪斯公司。恒温水浴锅，北京市医疗设备厂提供。WH-1微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂。
1.4 动物Wistar大鼠，SPF级，体质量（200±10）g，性别：雄性，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-0005；动物饲料：纯系鼠料，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供；动物饲养条件：室温20～25℃，湿度40%～60%，笼具及垫料定期清洗更换。
2 方法
2.1 造模取雄性大鼠50只，每只大鼠右下肢肌肉注射维生素D3 3×105 U/kg，并给予高脂饲料（2%胆固醇，0.5%胆酸钠，3%猪油，0.2%丙基硫氧嘧啶，94.3%基础粉末饲料，维生素D3粉剂1.25×106 U/kg）。7 d后行球囊损伤手术。另取10只作为空白对照，给予普通饲料。
球囊损伤手术：动物用戊巴比妥钠（35 mg/kg体重）腹腔麻醉，仰卧固定，皮肤消毒，正中切开颈部皮肤，分离左侧颈总动脉，结扎远心端，插入球囊，进入约8 cm，球囊内注入0.2 ml生理盐水，向回拉动3～4 cm，放水再进入约8 cm，注水、回拉，共3次。拔出球囊，层缝合皮下组织、皮肤。消毒切口皮肤，切口处洒适量注射用青霉素粉剂。术后连续7 d给予肌肉注射青霉素，切口处用碘酒消毒。
2.2 分组及给药术后按体重随机分为5组。高剂量组：苜蓿总皂苷提取物0.7 g/kg；中剂量组：苜蓿总皂苷提取物0.35 g/kg；低剂量组：苜蓿总皂苷提取物0.18 g/kg；阳性组：绞股蓝总苷片56 mg/kg；模型组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予高脂饲料；另设空白组：等体积蒸馏水，灌胃同时给予普通饲料。按体质量1.0 ml/100 g灌胃，1次/d，连续给药90 d。
2.3 取样及检测指标末次给药后，禁食不禁水12 h，断头取血，3 000 r/min离心15 min，分离血清。用紫外分光光度计测定血清总胆固醇(TCH ，PAP法)，甘油三酯（TG，PAP法）和高密度脂蛋白（HDL-C，PTG-Mg2+ -PAP法）的含量；并计算低密度脂蛋白（LDL-C）的含量和动脉粥样硬化指数（AI）。
分离主动脉，纵行切开，0.9%生理盐水冲洗干净，苏丹Ⅲ染色，照相，以百分率法算出斑块面积占动脉壁总面积的百分率，按分级法统计主动脉病变级别。计量资料以组间t检验进行统计比较，等级资料以秩和检验进行统计比较，百分率以卡方检验。主动脉斑块分级标准：0级-内膜表面光华，无奶油色变化，即无斑块；0.5级-内膜有广泛的奶油色或乳白色变化，但无凸出于表面的斑块；1级-有明显的奶油色凸起斑块，面积小于3mm2；2级-斑块面积大于3 mm2；3级-有许多大小不等的斑块，有的融合成片，大块的斑块面积超过3 mm2；4级-动脉内膜表面几乎为全为融合的斑块所覆盖。
主动脉用10%福尔马林溶液固定36 h后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，在切片机上横断面制成5 μm厚连续切片。HE染色片随机选取10个视野测定主动脉内膜厚度，内膜/中膜厚度比值。
分离心脏，用10%的福尔马林固定，再将心脏横切成3块，每块冰冻切片至少2片，用苏丹Ⅲ及苏木素染色，每个切片一般都观察10个动脉断面并按下列标准分级：0级-动脉内膜无脂质浸润；0.5级-动脉内膜有轻度脂质浸润；1级-内膜斑块占血管腔面积的1/4；2级-内膜斑块占血管腔面积的1/2；3级-内膜斑块占血管腔面积的1/2以上；4级-斑块几乎堵塞整个管腔。
分离肝脏、肾脏，10%福尔马林溶液固定36 h后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，在切片机上横断面制成5 μm厚连续切片，HE染色，镜检。
3 结果
3.1 苜蓿总皂苷提取物对血脂的影响高、中剂量组使高脂血症大鼠的血清TCH、TG、LDL-C水平明显下降，而HDL-C水平明显上升，AI明显下降，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），与绞股蓝总苷片组比较无显著性差异（P＞0.05）。低剂量组对高脂血症大鼠的血清TCH、TG、LDL-C水平和AI呈下降趋势，HDL-C水平呈上升趋势，但与模型组比较无显著性差异(P＞0.05），与绞股蓝总苷片组比较有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。表1 苜蓿总皂苷提取物对血脂的影响(略)
3.2 主动脉病变情况
3.2.1 肉眼观察空白组主动脉管腔光滑完整。模型组主动脉内膜可见针尖至绿豆大小的圆形或不规则黄色斑块或脂质条纹，病灶主要位于动脉分支开口及血管弯曲的凸面处，可见明显隆起内膜表面的灰白色斑块，局部血栓形成。苜蓿总皂苷提取物各组与模型组相对比，其病理改变显著较前者轻。
3.2.2 主动脉斑块的病变分级苜蓿总皂苷提取物各组能够降低主动脉斑块的病变平均等级及粥样硬化面积/主动脉面积，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05，P＜0.001)，低剂量组与绞股蓝总苷片组比较有显著性差异（P＜0.05）。结果见表2。表2 苜蓿总皂苷提取物主动脉斑块的病变的影响(略)
3.2.3 主动脉形态学观察各组动物胸主动脉经HE染色在显微镜观察发现，空白对照组管腔圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖,细胞完整，中膜主要见梭形平滑肌细胞；外膜较薄，为疏松结缔组织。模型组管壁明显增厚，平滑肌增生明显,细胞排列紊乱，纤维组织增生伴片状或点状钙化，弹性纤维层结构不清，形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块。内皮损伤组管壁内皮细胞脱落，内膜增厚,斑块表面纤维帽薄，突出的斑块内含有坏死物质，平滑肌细胞减少，纤维组织增生伴片状或点状钙化，中膜明显萎缩,呈较典型的成熟动脉粥样硬化斑块。苜蓿总皂苷提取物各剂量组随着剂量的增加内膜变得较完整平坦,浸入内皮下的单核细胞明显少于模型组中膜平滑肌层排列较整齐。胸主动脉内膜和中膜厚度用图像分析仪检测，苜蓿总皂苷提取物各剂量组与模型组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01或P<0.001），苜蓿总皂苷提取物低剂量组与绞股蓝总苷片组比较有显著性差异（分别P<0.05或P<0.01）。结果见表3，图1～6。表3 胸主动脉内膜和中膜厚度(略)