猪关节软骨细胞体外培养及其形成糖胺多糖能力的实验研究

                 作者：许宏权，黄向莹，陈晓洁，王传家，纪影畅

【关键词】  软骨细胞；体外培养；糖胺多糖

　　［摘  要］ 目的：观察软骨细胞体外培养的情况及其合成糖胺多糖的特点。方法：通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞，定量接种6×106个细胞于培养皿，加入培养基，每周传代一次，连续5周，留取所有培养液用阿利新蓝法（Alcian Blue）测定软骨细胞外分泌基质糖胺多糖（GAG）的变化；利用倒置显微镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果：软骨细胞在ｐＨ值为7.0，含10%胎牛血清的DMEM培养液中生长良好，体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质，第二代传代细胞分泌GAG的能力最强。结论：软骨细胞体外培养生长良好，合成大量的糖胺多糖类基质。传代第二代是最佳接种时间。

　　［关键词］ 软骨细胞；体外培养；糖胺多糖

　　Pig Articular Chondrocytes in Culture form Glycosaminoglycan

　　Abstract：Objective To observe chondrocytes in culture forming glycosaminoglycan.Methods Chondrocytes was cultured in plate(6×106 cells) and generated each week.while bFGF were put in the culture liquid the total times is five.GAG of cell cultures was determined by DMS GAG colorimetry assay from the first to the fifth week.Results chondrocytes grew well in DMEM medium with pH 7.0,containing 10% fetal calf serum.This study showed that chondrocytes in culture was the activitivest during the second week,the chondrocytes were showed obviously synthesized more GAG from the second to the fifth week.Conclusion It indicates that chondrocytes in culture form more GAG,The second generation that hands down from generation to generation is the best vaccination time.

　　Key words:Chondrocyte；Invitro culture；Glycosaminoglycan
　　
　　外伤和疾病可导致软骨缺损，由于软骨细胞属于增生能力极弱的终末细胞，关节软骨损伤后的修复是极其有限的。利用组织工程化软骨修复软骨缺损是临床应用前景十分广阔的课题。本研究对体外培养的关节软骨细胞的外分泌基质进行连续定量检测，探讨其合成糖胺多糖类基质的能力。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物与试剂  实验动物:贵州香猪(购自上海市第九人民动物实验中心)，体重(5±0.5)kg，雌雄不限。试剂:DMEM培养液，胎牛血清，0.15%的Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司）、0.25%的胰蛋白酶。

　　1.2  实验分组  软骨细胞每周传代一次，连续5周，共收集5组标本。

　　1.3  猪关节软骨细胞的提取  在无菌操作下，切下满月小猪膝、髋关节软骨，仔细剥离皮肤和软骨膜，用眼科剪将软骨组织剪成2 mm~3 mm大小的方块，置于离心管中，氯霉素冲洗液冲洗3次，再以磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗2遍后，加入两倍于软骨体积的0.15%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司）在37 ℃恒温振荡器内消化。

　　1.4  收集细胞  3 h～4 h后第一次收集软骨细胞。将上述悬浊液倒入150目不锈钢滤筛滤去软骨组织，用于隔夜消化，第二天早上收集。过滤的液体2 000 ｒ/min离心8 min，轻轻吸除消化液，加入PBS液,漂洗1次,加入细胞培养液16 ml，振荡混和制作经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液。锥虫蓝拒染实验观察细胞活力。

　　1.5  软骨细胞的培养  将软骨细胞悬液密度调整至6×106/ml，以1 ml分别接种于塑料培养皿，加入6 ml培养液（DMEM培养液加10%胎牛血清）。置入37 ℃恒温培养箱(5%CO2)培养［1］。

　　1.6  软骨细胞传代培养  细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察80%汇合，即进行传代。用血球记数板计数， DMEM培养液稀释为6×106/ml，以3 ml分别接种到培养皿内，加入3 ml培养液，37 ℃恒温培养箱(5%CO2)内培养［2］。

　　1.7  倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况。

　　1.8  软骨细胞外分泌基质糖胺多糖(GAG)的定量检测  阿利新蓝法（DMS）测定培养液中GAG含量。定量接种6×106个细胞于培养皿，每周传代一次，留取所有培养液进行检测。吸1 ml培养液，加入1.5%阿利新蓝溶液1.5 ml，室温放置10 min，480 nm比色，4硫酸软骨素作为标准溶液，绘制标准曲线。根据标准曲线求得样本GAG含量。

　　2  结果

　　2.1  倒置显微镜观察软骨细胞生长情况  刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强折光性。贴壁时间平均为8 h，延伸时间约20 h，5 d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，呈多角形。传代后，软骨细胞贴壁时间平均为3 h，延伸时间约6 h。连续培养至第6周，见细胞形态向成纤维细胞型转化，呈梭形，细胞间隙变大，轮廓增强，胞浆内可见空泡、脂滴，增殖速度减慢。

　　2.2  软骨细胞GAG含量测定  见表1。表1  猪关节软骨细胞合成GAG含量(μg)（略）

　　3  讨论

　　细胞外基质(ECM)是细胞附着的基本框架和代谢场所，是维持细胞正常生存、分化和运动的外环境。软骨细胞分泌的细胞外基质主要分为三类，胶原类：以II型胶原为主，是维持组织强度的来源；蛋白多糖类：主要为酸性糖胺多糖(GAG)，包括硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素；结构糖蛋白：如纤维粘连蛋白。其中GAG是软骨的主要细胞外基质,是关节软骨的主要成分之一,占透明软骨干重的20%~40%。可作为软骨细胞体外培养功能鉴定的主要指标。阿利新蓝GAG比色法是一种较好的测定细胞外基质中GAG含量的方法，其基本原理：GAG可溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，形成GAGDMS复合物，测定光吸收可以定量［3］。本实验对软骨细胞所分泌的基质连续定量检测，动态观察体外培养的软骨细胞的功能活性。体外培养的软骨细胞从第二周开始合成大量的糖胺多糖类基质，第二代传代细胞分泌GAG的能力最强。4周后GAG含量开始降低，软骨细胞功能和活力减退。体外培养的软骨细胞增殖能力低下限制了组织工程化软骨的研究。如何促进软骨细胞的生长，减慢软骨细胞衰老的速度，是组织工程化修复软骨缺损亟待解决的问题。

　　：

　　［1］  王传家，李宇，许宏权，等.一氧化氮对兔关节软骨细胞凋亡的影响［J］.实用美容整形外科杂志，2002，13（6）：324326.

　　［2］  王传家，李宇，许宏权，等.猪软骨细胞外分泌基质功能检测的实验研究［J］.汕头大学医学院学报，2000，13（2）：2223.

　　［3］  方福德,周吕,丁濂，等.医学实验技巧全书［M］.上册.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1995：679692.