罗勒胶囊抑制肿瘤血道自发性转移的实验研究*
作者：张丹，郑广娟，张静，夏丽英，聂克
【摘要】 目的 观察罗勒胶囊对肿瘤血道自发性转移的抑制作用。方法 选用小鼠子宫颈癌U14脾内移植后自发性肝转移模型，切取肝、脾、肺、肾等器官及腹腔内部淋巴结（包括幽门、肾门处淋巴结），组织学观察并进行肝转移程度的组织学分级；选用Lewis肺癌自发性转移模型，计数肺转移结节数并作病理组织切片观察。结果 罗勒胶囊大、中、小剂量组对小鼠子宫颈癌U14脾种植肝转移模型，均可使肝内转移结节数明显少于阴性对照组；对Lewis肺癌自发性转移模型，均可使肺转移结节数明显少于阴性对照组，并使转移率下降。结论 罗勒胶囊可抑制肿瘤血道自发性转移。
【关键词】 罗勒胶囊；血道转移；自发性转移；实验研究
肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞离开原发生部位，突破基底膜和细胞外基质构成的屏障，侵犯毗邻的正常组织。而转移即恶性肿瘤细胞借助血道、淋巴道等途径，在远离肿瘤原发生长部位的器官内形成继发瘤的过程［1］。肿瘤侵袭及转移是肿瘤患者失败的主要原因。为了能彻底治愈癌症，控制肿瘤侵袭和转移是关键。目前虽有一些抗肿瘤侵袭和转移的药物在临床上应用，但效果不理想。为此，寻找抗肿瘤侵袭和转移药物是当务之急，特别是寻找高效、低毒的天然产物更具有实用价值。罗勒胶囊是从植物罗勒（Ocimum basilicum Lim）中提取而制成的天然的抗肿瘤转移的药物。本文将其抑制肿瘤血道自发性转移的实验研究介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 昆明种小鼠体重，体重18～22g，由山东大学西校区实验动物中心提供，合格证号200001002；C57BL/6小鼠，体重18～22g，由医学院动物实验中心提供，合格证号SCXK11-00-0006。
1.1.2 瘤株 Lewis肺癌瘤株小鼠，子宫颈癌U14腹水型小鼠均由中国医学科学院动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 对小鼠子宫颈癌U14脾内移植后自发性肝转移模型的作用抽取U14腹水瘤，台盼兰排斥法计数活细胞数，用无血清的RPMI-1640培养液调整瘤细胞浓度为108/ml备用。用0.25%戊巴比妥钠0.4～0.6ml/只，腹腔注射麻醉小鼠，在小鼠的左侧腹部（脾区）消毒后，剪开约1cm的小口，暴露脾脏并固定，用4号针头在脾脏的一端包膜下缓慢地注入0.01ml癌细胞悬液，将脾脏退回腹腔内，缝合切口。24h后随机分组给药。第1组阴性对照组给阴性对照液灌胃0.3ml/只；第2组罗勒大剂量组（简称罗大组）；第3组罗勒中剂量组（简称罗中组）；第4组罗勒小剂量（简称罗小组），以上均为灌胃给药，用药14天，给药容量为0.3ml/20g；第5组阳性对照组，给丝裂霉素0.1mg/kg，于接种后第1、3、5天腹腔注射。末次用药60min后处死小鼠，切取肝、脾、肺、肾等器官及腹腔内部淋巴结（包括幽门、肾门处淋巴结），Bouin氏液固定，HE染色，组织学观察来确定各器官及淋巴结是否有U14癌的转移。肝转移程度的组织学分级标准为0级：无转移；1级：肝内有1～2个200～500μm的小转移灶；2级：肝内有3～5个小转移灶或1～2个200～1000μm的较大转移灶；3级：肝内存在广泛转移灶。以上试验重复3批，每批动物同一性别，结果用Mann Whitneg-Teet进行统计学处理。并统计转移率，转移率=转移动物数/组内动物数。
1.2.2 对Lewis肺癌自发性转移模型作用 从荷瘤小鼠上剥离并选取生长良好的瘤块，按瘤块（g）：生理盐水（ml）为1∶3的比例作匀浆，在C57BL/6小鼠腋窝下接种肿瘤匀浆液0.2ml/只，接种24h后随机分组，分组及给药方法同上，第21天颈椎脱臼处死动物，称小鼠体重、瘤重和肺重，肺Bouin氏液固定，解剖镜下计数肺部正、反面及肺叶间的转移瘤灶数，做病理组织切片观察，最后用Mann-Whitney U-teet的方法检验肺转移结节数的组间差异。以上实验共重复三批，每批动物同一性别。
2 结果
2.1 罗勒胶囊对小鼠子宫颈癌U14脾内移植后自发性肝转移模型的作用
2.1.1 三批实验结果 见表1。
2.1.2 肝、脾病理组织学检查结果 随机取第一批实验动物脾做常规石蜡切片，HE染色，目的是判断脾种植是否成功及观察肝转移情况，以上均在光镜下观察并拍照，结果如下：
阴性对照组（11只）：脾：各动物脾包膜下均见种植癌，且有广泛性坏死。肝：除5号肝外，其余肝组织包膜下及肝内均见转移性U14宫颈癌瘤灶，3号门静脉及10号肝内均见癌栓。罗勒胶囊大剂量组（12只）：脾：各动物脾包膜下及脾内均见种植癌，脾结构有的破坏。肝：3号、12号动物肝内或包膜下，可见转移性U14宫颈癌瘤灶，大小不一，数量很少，其余动物肝内未见转移灶。罗勒胶囊中剂量组（12只）：脾：各动物脾包膜下均见种植癌，有的较广泛，脾结构有破坏。肝：1、2、7、8号动物肝内或包膜下，可见转移性U14宫颈瘤灶，灶小，数量少，其余动物肝内未见转移灶。罗勒胶囊小剂量组（11只）：脾：各动物脾包膜下，均见种植癌，有的较广泛。肝：3、6号动物肝内或包膜下，可见转移性U14宫颈癌瘤灶，瘤灶范围小，数量少，其余动物肝内未见转移灶。丝裂霉素组（11只）：脾：各动物脾包膜下均见种植癌，有的较广泛，脾结构有破坏。肝：1、3、8、9号动物肝内或包膜下，可见转移性U14宫颈癌瘤灶，瘤灶范围大小不一，数量不等，其余动物肝内未见转移灶。
2.2 罗勒胶囊对Lewis肺癌自发性转移模型作用
2.2.1 三批实验结果 见表2。
表1 罗勒胶囊对小鼠子宫颈癌U14脾内移植肝转移模型作用结果
注：与阴性对照组比，*P<0.05，**P<0.01
表2 罗勒胶囊对小鼠Lewis肺癌自发性转移模型作用结果 (x±s)
注：与阴性对照组比，*P<0.05，**P<0.01
2.2.2 肺组织病检查结果 随机取第一批实验动物肺标本，常规石蜡切片、HE染色，光镜下观察并拍照，各组结果如下：阳性对照组（10只）：各动物肺内均见转移性Lewis肺癌瘤灶，瘤灶范围广，数量多，有围绕血管生长现象，偶见血管内瘤栓。罗勒胶囊大剂量组（10只）：除4、9号动物外，其余动物肺内均见转移性Lewis肺癌瘤灶，但范围小，数量少，未见围绕血管生长现象，未见瘤栓。罗勒胶囊中剂量组（10只）：除7、8号动物外，其余动物肺内均见转移性Lewis肺癌瘤灶，瘤灶范围有大、有小，未见围绕血管生长现象。罗勒胶囊小剂量组（10只）：各动物肺内均见转移性Lewis肺癌瘤灶，范围小，数量较多，未见围绕血管生长现象。丝裂霉素组（10只）：各动物肺内均见转移性Lewis肺癌瘤灶，范围大小不一，数量多，有围绕血管生长现象。
3 结论
罗勒胶囊大、中、小剂量组对小鼠子宫颈癌U14脾种植自发性肝转移模型有抗肿瘤转移作用，表现在三批实验中均使肝内转移结节数明显少于阴性对照组（P<0.01，P<0.05，P<0.01），三批实验中使转移率也明显低于阴性对照组（P<0.01，P<0.05，P<0.01），肝脏转移程度也低，且对其他器官转移范围也小。罗勒胶囊大、中、小三个剂量组对小鼠Lewis肺癌自发性转移模型有抗肿瘤转移作用，表现在三批实验中均使肺内转移结节数明显少于阴性对照组（P<0.01，P<0.01，P<0.05），还能使转移率下降，病理组织切片也得到证实。
4 讨论
将小鼠子宫颈癌U14细胞移植于昆明系小鼠脾脏的包膜下，肿瘤增殖后可侵入脾血窦，沿脾静脉进入门静脉到达肝脏，在肝脏形成转移瘤。Lewis肺癌移植于动物皮下、肌肉、爪垫等特定部位移植瘤增殖后开始侵袭周围的正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环被运输到靶器官，粘附于靶器官的血管壁上，并穿出血管，癌细胞增殖成为克隆，最后形成转移癌。上述过程基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤，可用于转移机制探讨和抗癌转移药物的筛选及研究［2］。
罗勒胶囊是从植物罗勒（Ocimum basilicum Lim）中提取而制成的天然药物。我们通过其对肿瘤转移过程中血液流变学的影响观察，发现罗勒胶囊具有抗血小板的作用，其可能抑制了细胞的粘附性和瘤栓的形成因而抑制了瘤细胞的粘附、游走、穿透而抗转移［3］。本研究进一步证实了它有明显的抗肿瘤转移的作用。但是抗血小板的活血化瘀中药也不一定均具有抗肿瘤转移的作用，甚至有的还促进肿瘤转移［4，5］，所以，罗勒胶囊抗肿瘤转移作用是多靶点的，其抗肿瘤转移的作用还有待进一步探讨。
【】
1 Aznavoorian S，Murphy AN，Stetler-stevenson WG，et al.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis.Cancer，1993，71(4)：1368-1383.
2 韩锐.抗癌药物研究与实验技术.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社，1997，370.
3 张丹，张静，郑广娟，等．罗勒胶囊对肿瘤转移过程中血液流变学影响的研究.山东中医药大学学报，2005，29（1）：61.
4 李学汤，王永泉，傅乃武，等．几种活血化瘀药物对小鼠肝细胞形成肺转移影响的初步实验观察．中医杂志，1980，21（8）：75.
5 张培彤，朴炳奎．血瘀证与恶性肿瘤．中国中西医结合外科杂志，1998，4(6)：378.
