肝纤维化标志物联合测定的临床意义
【摘要】 目的：探讨血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原(Ⅳ?C)等肝纤维化标志物联合测定在诊断早期肝纤维化中的意义。方法：采用放射免疫分析法对400例急慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者及98例健康人对照组（排除相关疾病者）进行血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ?C测定，并予以统计分析。结果：急慢性肝炎、肝硬化、肝癌组的肝纤维化标志物测定结果均在不同程度高于对照组。结论：肝纤维化标志物联合测定在肝纤维化的诊断、肝纤维化活动度及临床抗纤维化效果评价有重要意义。
【关键词】 肝纤维化 型前胶原 Ⅳ型胶原 透明质酸 层粘连蛋白 放射免疫分析
近年来肝纤维化日益受到人们的重视，已成为肝病研究领域的热点。诸多病因如病毒、酒精、药物等所致的肝细胞炎症、坏死均可引起肝纤维化。尤其我国是世界公认的乙肝大国，发病人数居高不下，肝纤维化继续可导致肝硬化，部分可发生癌变。肝纤维化尚属可逆阶段，若能早期发现，给予有效治疗则可防止发展为肝硬化、肝癌。如何诊断肝纤维化，超声波、影像等一旦发现多数已在中期以上肝硬化阶段，能够早期诊断肝纤维化的方法至今主要依靠肝活检，临床称之为金标准。但因有创伤性，多数患者不愿接受，也无法准确地判断肝纤维化的活动度，更难以动态观察。血清肝纤维化标志物测定是无创伤性的，是从生化代谢方面判断肝纤维化的活动度，可进行动态观察，虽不能代替肝活检，但其与肝纤维化程度密切相关，因此临床上有其实用诊断价值。近年来我们参阅专家论著，结合复习，将我科2000年5月至2006年12月498例肝纤维化标志物检测结果分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 一般资料
患者根据1995年第5次全国传染病寄生虫学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案中病毒性肝炎诊断标准，将498例受检者分组：各型肝炎及肝炎后肝硬化病例364例，其中急性肝炎患者72例（男性64例，女性8例，年龄11岁～65岁，平均年龄41.5岁），轻度慢性肝炎患者84例（男性36例，女性48例，年龄18岁～60岁，平均年龄44岁），中度慢性肝炎患者76例（男性68例，女性8例，年龄27岁～64岁，平均年龄39岁），中度慢性肝炎患者60例（男性52例，女性8例，年龄35岁～71岁，平均年龄48.3岁），肝炎后肝硬化患者72例（男性56例，女性16例，年龄29岁～65岁，平均年龄45.5岁）。另有原发性肝癌术前患者18例，术后患者18例及对照组（排除相关疾病者）98例 ，测定肝纤维化标志物水平。
1.2 检测方法
放射免疫法，试剂:透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(IV?C)由天津九鼎医学生物工程有限公司提供；PCⅢ由上海海研医学生物技术有限公司提供；严格按试剂说明书进行操作。
1.3 仪器
FJ2003/50P放射免疫γ计数仪（国营西安二六二厂），DDL-5低温离心机（上海安亭仪器厂）。
2 结果
见表1。表1 各型肝炎患者及对照组血清Ⅳ-C水平(略)
血清HA含量在肝病时从急性肝炎到肝硬化各组变化显著，与正常对照及前一组比较差异均有显著性（P<0.01）。尤其在肝硬化时升高迅速。见表1，但血清LN、PCⅢ、Ⅳ?C含量在对照组和急性肝炎两组间差异无显著性（P>0.05），而两组分别与轻度、中度、重度慢性肝炎，肝炎后肝硬化和肝癌手术前后各组间差异均有显著性（P<0.01）。中度与重度慢性肝炎组比较差异无显著性（P>0.05），重度肝炎组血清LN、PCⅢ、Ⅳ-C等的平均水平明显高于中度慢性肝炎组水平。中度慢性肝炎与肝炎后肝硬化和肝癌术前两组间比较差异有显著性（P<0.01）。重度慢性肝炎与肝炎后肝硬化两组间差异无显著性（P>0.05）,肝炎后肝硬化组血清LN、PCⅢ、Ⅳ?C平均水平明显高于慢性肝炎组水平。重度慢性肝炎与肝癌术前两组间差异有显著性（P<0.01）。肝炎后肝硬化与肝癌术前两组间差异无显著性（P>0.05）。但肝癌术后组与肝炎后肝硬化及肝癌术前组间差异均有显著性（P<0.01）。与上述国内外各组报道结果基本一致。
3 讨论
3.1 血清肝纤维化标志物
肝纤维化的病理改变是结缔组织增生，其实质是细胞外基质的沉积，主要成分是胶原蛋白，还有糖蛋白和蛋白多糖等多种物质组成。测定血清中这些成分或其降解产物以及参与代谢的酶或调控因子等可作为肝纤维化标志物。近年来报道可作为血清肝纤维化标志物的种类日益增多，不下20种、30种［1］。现就其中有实用价值、常用的血清肝纤维化标志物介绍如下：
3.1.1 Ⅲ型胶原
血清肝纤维化标志物中报道最早的是Ⅲ型胶原氨基端肽（PⅢP）。1979年Rohde等首先报道从牛胎皮中提取PⅢP，建立了测定血清PⅢP的放免法，并证实肝纤维化时血清PⅢP含量明显升高。1983年国外开始有商品试剂盒供应后，陆续有大量报道并应用于临床，但国内由于试剂盒需进口，价格昂贵，报道较少。Bentsen等观察肝活检，在光镜下尚未发现肝纤维化，而在电镜下开始发现时，血清PⅢP已有升高。但近年来不少学者报道，当肝脏炎症、坏死时PⅢP也有升高，可能由于原有胶原降解增加。所以多数学者认为血清PⅢP与两者都有可能相关，但与肝纤维化相关为主。因此血清PⅢP仍然是肝纤维化的重要标志物。
1985年Galambos等报道［2］从山羊中提取PCⅢ，建立了测定血清中大分子PCⅢ的放免法。PⅢP是PCⅢ降解下来的肽片段，其分子量为45 000，较PCⅢ约小10倍。作者用此法测定了50例肝病患者血清PCⅢ，证实其血清含量与肝活检中纤维化程度呈正相关，因此认为血清PCⅢ与PⅢP有相似的临床意义。1992年李伟道等建立了PCⅢ的放免分析法［3］。经国内14家应用此法，总结2 766例血清PCⅢ测定结果，进行了临床评价：各家测定结果十分一致，肝硬化和慢活肝血清PCⅢ均有显著升高，而急肝和慢迁肝略升高或在正常范围(<210 ug/L)；经102例肝活检观察，按照Knodell的肝组织病理指标记分，血清PCⅢ仅与肝纤维化分值呈密切正相关（r=0.688,P<0.01)；血清PCⅢ与PⅢP（国外进口试剂盒）同时测定，两者呈密切正相关。
3.1.2 Ⅳ?C
Ⅳ?C是构成基底膜的主要成分。根据其抗原结构，可用相应抗体分别测定7 s段（氨基端）、NCl（羧基端）或主螺旋区。国内外已有较多肯定上述标志物临床诊断价值的报道。如冯晓霞等［4］报道采用日本富士公司进口的一步夹心酶联法测定Ⅳ?C大分子，其血清水平与肝纤维化分级呈正相关，并有较好的早期诊断价值。李伟道等从胎盘中提取Ⅳ?C，建立了放免法［5］，测定结果与上述报道基本一致。
3.1.3 Ⅰ型胶原
报道测定不同成分有：氨基端肽（PINP）、羧基端肽（PICP）、I型前胶原（PCI）或其大分子等，临床评价不一。1990年Hartmann等［6］建立了测定大分子的放免法，测定了91例正常人和146例各种肝病患者，结果认为仅在肝硬化中有显著升高。1997年李伟道等建立了PCI的放免法［7］，测定了246例各种肝病患者，结果与上述报道基本一致，肝硬化组中血清PCI显著升高（阳性率75%），而其他各组无显著性升高（阳性率0%～11.7%）。血清PCI升高的机理可能由于在肝纤维化过程中早期肝脏Ⅲ型胶原含量多于Ⅰ型，而后期肝硬化时Ⅰ型多于Ⅲ型，因此反映在血中亦不一致。以上说明测定PCI对判断肝纤维化是否发展为肝硬化有临床意义。
3.1.4 HA
HA是常用的标志物，临床报道已较多。HA是一种糖胺多糖。1991年张鲁榕等［8］建立了测定HA放免法，测定245例各种肝病血清HA，其水平随着肝炎的发展：急肝-慢活肝-肝硬化，逐步升高。李伟道等同时测定167例各种慢性肝病血清HA和PCⅢ，在40例代偿性肝硬化中PCⅢ的敏感性为87%，高于HA55%；但在失代偿性肝硬化中HA反而高于PCⅢ。关于血清HA升高的机理：主要由于肝损害累及内皮细胞功能，摄取与分解HA能力下降。在早期肝硬化往往伴有活动性肝纤维化，血清PCⅢ可显著升高，但此时肝损害尚不严重，血清HA不一定升高。反之至晚期，多属陈旧性肝纤维化，血清PCⅢ可以不高，而此时肝损害严重，血清HA可有显著升高。
3.1.5 LN
LN是一种糖蛋白，为基底膜特有成分。在肝纤维化时LN和Ⅳ?C沉着在Disse间歇形成内皮基底膜，呈毛细血管化，这样既妨碍了肝细胞与肝窦之间各种营养物质的交换，又形成门脉高压，这在肝硬化过程中起到重要作用。Gressner等报道40例肝纤维化和肝硬化患者，证实门静脉压力与血清LN呈密切正相关，而与血清PⅢP无相关。
3.1.6 脯氨酸肽酶（PLD）
PLD是一种水解酶，胶原蛋白富含脯氨酸，PLD能水解其羧基末端，与胶原的降解密切相关。血清PLD测定采用一般生化方法，比较简单。诊断肝纤维化的敏感性可达90%，但其特异性仅60%。在肝炎时PLD与ALT同时升高，可能与炎症、坏死有关；若PLD升高而ALT正常，则可能与肝纤维化有关。
3.2 血清肝纤维化标志物的临床应用价值
各种原因引起的肝细胞脂肪变、胆汁淤积及炎症等，达到一定严重程度时均可刺激肝内局部的储脂细胞、枯否细胞，静止的纤维母细胞增生并形成胶原纤维，增多的纤维组织形成细小的条索和菲薄的间隔，使肝脏纤维化变。肝纤维化是肝硬化的早期阶段，对它的早期诊断和及时地抗纤维化，对肝硬化的防治、延缓、逆转等都起到了极大的作用。单一项目检测阳性率仅为30%～35%，两项以上联合测定时阳性率可提高到75%～90%。
3.2.1 联合测定的必要性
肝纤维组织的组成成分复杂，除主要成分胶原蛋白外，尚有糖蛋白和蛋白多糖等多种物质，且其形成的机理亦不完全相同。因此仅凭测定某一种标志物诊断肝纤维化是不可靠的，必须选择几种联合测定。至于选择哪几种为好，早期Pleblani等复习了273篇有关肝纤维化标志物的文章［9］，认为PⅢP、HA和LN联合测定是可取的。后来有Pilette等［10］分析了243例慢性肝病患者的肝活检中纤维化，采用半定量的记分法和定量的机图象分析法，统计血清肝纤维化标志物与肝纤维化的相关性，结果以HA、LN和PⅢP为最高，与前者意见一致。国内学者李伟道等收集了20多篇文章意见，采用了三类标志物：PCⅢ、HA和LN或Ⅳ?C联合测定取得了满意效果。按1995年北京第5次全国传染病会议修订的肝炎诊断标准［11］，慢性肝炎分类要求包括肝纤维化程度，认为，慢性轻度肝炎：上述三种标志物均正常或其中一或两种轻度升高；慢性重度肝炎或肝硬化：两种以上标志物重度升高；慢性中度肝炎：介于轻度与重度肝炎之间。
骆抗先编著的乙型肝炎一书中［12］，叙述有关血清肝纤维化标志物联合测定数种方案，鉴别慢性肝病的敏感性、特异性和诊断符合率，见表2，值得。表2 HA、PCⅢ、LN、PLD鉴别各种慢性肝炎的效果(略)
3.2.2 动态观察的意义
动态观察血清肝纤维化标志物测定的水平，对判断病情是否有重要意义。肝活检检查为创伤性的，在临床上不可能反复进行，因而受到限制。而血清肝纤维化标志物可长期动态观察：若其水平持续升高，提示肝纤维化继续发展；若有所下降，则肝纤维化有所好转。此外，在判断抗肝纤维化药物治疗效果上，动态观察为重要依据。
3.2.3 肝硬化、肝癌的预防
肝纤维化发展至后期，形成结节则为肝硬化，而肝癌的发生又与肝硬化密切相关。据全国肝癌病理协作组收集各地500例肝癌进行分析，其中94.8%合并肝硬化和肝纤维化，前者为84.6%，后者为10.2%。说明我国大多数肝癌是在肝纤维化基础上发生的。血清肝纤维化标志物的推广应用，可早期发现肝纤维化，以利于及时治疗，则可防止发生肝硬化、肝癌。
【参考】
［1］Schuppan D,Stolzel U,Oesterling C,et al.Serum assays for liver fibrosis［J］. J Hepatol,1995,33(suppl 2):82?88.
［2］Galambos MR,Collins DS,Galambos JT, et al. A radioimmunoassay procedure for type III procollagen Its use in the detection of hepatic fibrosis［J］. Hepatology，1998,5:38?42.
［3］李伟道，刘兴明，林丁，等.125I标记人III型前胶原建立放免法诊断肝纤维化［J］.肝脏病杂志，1993，1（2）：80?84.
［4］冯晓霞，沈鼎明，王景.血清Ⅳ型胶原对肝纤维化临床价值的初步探索［J］.中华内科杂志，1995，34（7）：439?443.
［5］刘预，李伟道，林丁，等.Ⅳ型胶原放免分析法的研究［J］.中华肝脏病杂志，1997，5（2）：75?76.
［6］Hartmann DJ, Trinchet JC, Blum SR, et al. Radiommunossay of type I collagen that mainly detects degradation products in serum Application to patients with liver diseases［J］.Clin Chem,1990,36:421?428.
［7］刘兴明，李伟道，林丁，等.血清Ⅰ型前胶原放免法的建立和诊断肝纤维化的初步应用［J］.中华肝脏病杂志，1998，6（4）：198?200.
［8］张鲁榕，孔宪涛，张国治，等.血清透明质酸在诊断肝硬化中的价值［J］.中华消化杂志，1991，11（2）：67?68.
［9］Plebani M, Burlina A. Biochemical markers of hepatic fibrosis［J］. Clin Biochem,1991,24:219?239.
［10］Pilette C, Rousselet MR, Bedossa P, et al. Histopathological evaluation of liver fibrosis:quantitative image analysis vs semi?quantitative scores［J］. J Hepatol,1998,28:439?446.
［11］1995年北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订.病毒性肝炎防治方案（试行）［J］.中西医结合肝病杂志，1996，6（1）：50?53.
［12］骆抗先.乙型肝炎［M］.第1版.北京：人民卫生出版社，1997：379?382.
