兔急性心肌梗死模型血运再通的实验研究

【摘要】  目的：研究急性心肌梗死血运再通与心交感神经损伤关系。方法：完全闭塞12只雄性新西兰大白兔冠状动脉左前降支45 min后血运再通4 h，以131碘?间位碘代苄胍（131I?MIBG）、99m锝?甲氧基异丁基异腈(99mTc?MIBI)双核素放射自显影，并对照两种自显影与TTC组织染色间的联系。结果：血运再通4 h，TTC组织染色面积缺损百分比小于无血运再通组，131I?MIBG及99mTc?MIBI自显影在同一区域摄取存在差异性，以急性无血运再通组，131I?MIBG缺损面积(38.8±3.1)%比组织TTC染色及99mTc?MIBI显影缺损大(P<0.001)。结论：急性无血运再通心肌梗死，心交感神经末梢颗粒损害敏感早而广，血运再通早能阻止神经损伤，本实验以MIBG显影，能够监测心肌梗死病变心交感神经活性改变。

【关键词】  心肌梗死

　　The Experiment Study of the Relationship of Blood Reperfusion and Sympathetic Nerve Impared Associated in Myocardial Infarction

    Abstract: Objective To investigated the relationship between blood reperfusion and sympathetic nervous injuring in acute myocardial infarction. Methods Autoradiography with 131  Iodine?Metaiodobenzylguanidine (131I?MIBG ) and 99m  Tc?sestamibi (99m Tc?MIBI) was performed in 12 male New Zealand White rabbits of which left anterior descending coronary artery was complete occluded for 45 min followed by 4 h blood reperfusion in acute myocardial infarction. Infarct areas identified by triphenyl tetrazolium chloride（TTC）staining and compared to the two autoradiography results. Results Whether Infarct areas, myocardial uptakes 131  I?MIBG and 99m  Tc?MIBI show defect larger than blood reperfusion groups, especially for non?blood reperfusion groups. 131  I?MIBG autoradiaography imaging defected area (38.8±3.1%) was larger than any other TTC staining and all of 99m  Tc?MIBI imaging defect size (P<0. 001). Conclusion The experimental results suggests that sympathetic nerve injuring sensitive earlier and larger than myocardial infarction in non blood reperfused AMI. Blood reperfusion could protect sympathetic nervous from injury especiallyin AMI group; of which supports MIBG scintigraphy as a non?invasive tracer to measure sympathetic innervations changed and to provide powerful tools to assess the prognosis altered sympathetic nerve function in early AMI.

    Key words Myocardial infarction; Ischemic reperfusion; Sympathetic nerve impaired; Dual isotopes imaging; Animal experiment

    心肌梗死后，血浆内儿茶酚胺瞬间升高，梗死灶与非梗死灶内，去甲肾上腺（NE）有不同程度耗竭，交感神经活性与分布发生变化，心交感神经元突触信号传导受阻，导致心律失常等并发症。
    本实验利用心肌灌注显影剂（99mTc?Sestamibi，99mTc–MIBI）及交感神经受体显影剂（131I?Metaiodobenzylguanidine，131Iodine MIBG）双核素放射自显影。依据显影结果，结合染色，定量分析131I?MIBG与99mTc?MIBI放射自显影之间关系。电镜下观察梗死灶与非梗死灶交感神经末梢及心肌细胞超微结构变化，探讨心肌缺血下心交感神经受体损伤与心肌细胞改变之间联系及相关机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  设计 

　　12只雄性新西兰大白兔（体质量3.2 kg~3.4 kg）由第四军医大学实验动物中心提供。 采用随机对照的方法建立心肌梗死动物模型，分为血运再通组(n=6)与无血运再通组(n=6)。

　　1.2  地点与对象 

　　2003年5月至2003年10月在西京核医学科与病理科完成，实验所采用的材料与仪器：131碘?间位碘代苄胍（131 I?MIBG）放射性比活度2.03 GBq/mmol，放化纯为98%以上（购自北京401核能原子研究所，）。99m锝?甲氧基异丁基丙腈（99m Tc?MIBI）放射性比活度33.15 GBq/mmol，放化纯99.1%，（购自广东希埃核药学西安分公司，中国）。氯化三苯四唑（2,3?triphenyl ?tetrazolium chloride TTC，SIGMA公司），冰冻组织包埋液（OCT液, SIGMA公司），10 g/L磷酸缓盐冲液（10 g/L PBS），电镜染色试剂全套（由第四军医大学电镜室提供）。STORM860标准磷屏（分子动力公司，美国），LEICA?CM1900恒温冰冻切片机（LEICA，德国）。JEOL?JEM?100SX透射电镜（JEOL 公司，日本），NOVA超薄切片机（NOVA公司，瑞典），UTHSCSA ImageTool（IT）3.0面积分析软件及Adobe Photoshop 6.0（公用软件）。

　　1.3  主要参与者 

　　西安市第四军医大学核医学科与病理科专业人员协作完成，本研究的数据整理由第四军医大学统计教研室尚磊教员协助处理，在模型设计之前进行了预实验进行，动物模型喂养于西京医院骨科动物实验室。

　　1.4  急性心肌梗死动物模型 

　　动物模型采用林国城、周谊等［1，2］建立的模型，简而言之，经耳沿静脉麻醉。沿胸骨左侧第5肋间隙开胸（不破坏胸膜）靠近冠状动脉左前降支近端游离约1.0 cm，5/0无创缝合线套管法穿过LAD结扎。按实验目的，血运再通组于结扎LAD后45 min，松开结扎圈2 h，形成再灌注，见下方实验流程图解。

　　1.5  双核素放射自显影程序
 
　　所有实验动物当动脉结扎2 h 45 min或动脉再开放2 h时，将活度为14.8 MBq（0.4 mCi）的131 I?MIBG注入耳沿静脉，2 h后再将活度为185 MBq(5 mCi) 的99m Tc?MIBI注入同一静脉。15 min用100 g/L氯化钾10 ml处死动物并迅速摘除心脏，快速电镜取材，冰冻组织液（OCT）包埋。沿心尖向基底部连续切片，每切30次收集2次厚度为20 μm的切片，作为放射自显影样本；或40 μm切片作TTC染色，将放射自显影切片平铺在磷屏上曝光4 h，完成99m Tc?MIBI放射自显影。清屏器处理磷屏并放置3 d待99m Tc完全衰变，再将同一显影切片放置到磷屏上曝光4 d，按以上操作程序，得到131 I?MIBG放射自显影，根据显影结果，结合TTC染色差异，选择感兴趣区，IT3.0图形软件分析，定量测定显影相素间灰度差异值，使99m Tc?MIBI及131 I?MIBG放射自显影像素数值转化，用百分比表示(％)。

　　1.6  主要结局及观测指标 

　　通过病理组织学的对照分析，主要观察心肌缺血下，131 I?MIBG与99m Tc?MIBI放射自显影在反映心交感神经受体减损与心肌细胞损伤是否具有一致性。

　　1.7  统计学处理 

　　利用SPSS10.0统计软件对所得的数据进行分析，数据用±s表示，不同的组别（间）之间采用完全随机配对性t检验或ANOVA分析，当P<0.05为二者差异有统计学意义界限，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

    用IT3.0软件及Adobe Photoshop 6.0图片编辑器，将131 I?MIBG、99m Tc?MIBI自显影与组织TTC染色数据转化如表1所示：

    TTC染色结果与99m Tc?MIBI及131 I?MIBG放射自显影的对比结果，急性无血运再通组TTC染色面积缺损百分比值为(25.7±2.3)%，高于血运再通组(23.5±2.4)%（t=2.07,P=0.04）。而MIBG自显影血运再通组与相对应的无血运再通组相比较，MIBG自显影面积缺损百分比值远大于血运再通组，两者之间百分比值分别为(38.8±3.1)%和(33.7±2.3)%（t=3.91,P=0.000）。（见表1与图1）从表1中可以观察到：无血运再通组MIBI自显影面积缺损百分比值分别为(26.3±2.8)%和(23.6±2.2)%（t=3.42,P=0.004）两者之间差异有显著性。而MIBI自显影与TTC染色之间总体趋势表明：两者之间差异无显著性。表1  急性心肌梗死区染色与自显影面积缺损量化百分比对照表（略）注：与A1相比，aP<0.05，bP<0.01；与TTC染色相比，cP<0.05，dP<0.01；与131 I?MIBG自显影缺损区相比，eP<0.05，fP<0.01。

　　3  讨论

    核素在体示踪技术，初步揭开了生物体新陈代谢内幕，洞悉生命现象?本质，对疾病发病原因和药物，作用起到举足轻重。一些研究表明［3~5］：心肌梗死后，心交感神经活度异常激活，容易导致心律失常、心力衰竭等多种并发症，去甲肾上腺素（NE）类似物间碘苄胍（MIBG），为一种假神经递质，被神经原摄取、储存、释放机制与NE基本一致，随心肌血流运输至心交感神经末梢，与特异性转体蛋白结合，聚集于交感神经元节后神经节，却以磷苯二酚?0?甲基转移酶及单胺氧化酶受体配体结合，但不能入细胞参与细胞氧化代谢。利用这一特性，可被多种核素标记，作为受体显影示踪剂，1988年Minardo等［6］首先将MIBG用于心肌显影，判断心肌梗死病变后交感神经损伤；同年，Sisson等［7］也进行相同研究，将MIBG引用于心肌神经损伤的临床应用。
    本实验选择131 I?MIBG、99m Tc?MIBI双示踪，研究心肌梗死早期血运再通对交感神经的影响，实验结果表明：心肌梗死灶及临近区域，131 I?MIBG面积缺损百分比值与99m Tc?MIBI相比，具有不匹配性；以急性无血运再通心肌梗死组尤其突出，MIBG缺损范围超过其他两种检测方法，三者之间面积缺损百分比值分别为(38.8±3.1)%比(25.7±2.3)%及(26.3±2.8)％，P<0.01。而在急性血运再通心肌梗死组，MIBG自显影面积缺损百分比值与相对应的组别之间差异存在显著性，MIBG面积缺损百分比值比无血运再通低，表明血运再通功能对交感神经具有保护作用。这一结论与Iwasaki T等［8］采用大鼠为实验对象，结扎冠状动脉左前降支，形成急性心肌梗死血运再通模型，采用201Tl及125 I?MIBG双示踪法，研究心肌梗死病灶交感神经受损分布，结果基本一致。

    心肌梗死后，为什么会造成梗死病变早期心交感神经损伤范围超过实际梗死灶。可能存在以下几种机制：首先，由心交感神经的解剖位置与冠状动脉走向伴行，心肌梗死后，缺血可能导致神经突触前端损害，使交感神经末梢活性功能低下，可以导致缺血症状加重，进一步损伤交感神经；其次，发生心肌梗死后，心肌细胞及神经末梢内ATP大量耗竭，由于神经末梢对ATP的依赖性，远远超过心肌细胞对能量的依赖，一旦出现能量改变，神经末梢就会损伤，即便是迅速采取补救措施，这种损伤仍然持续进行，很少出现可逆性修复；第三，透壁或非透壁性心肌梗死，也影响神经末梢功能。为了验证以上假说，Sakata K等［9］研究一组患者，在发生心肌梗死病变后4 d~4周期间，运用123 I?MIBG与99m Tc? tetrofosmin双示踪SPECT显影得到证实。Michael W等［10］用20只狗心肌梗死再灌注模型，也论证了急性心肌梗死，交感神经损伤范围比实际梗死灶早而且广泛，尤其以梗死病变发生几小时内最明显，但没有观察危险与梗死病灶中，神经末梢超微结构的改变。本实验在观察核素分布与实际梗死灶大小不一致。

　　4  实验结论

    无血运再通4 h，心肌摄取MIBG显著下降，经血运再通，MIBG缺损程度不如急性无血运再通组广泛，这就表明：交感神经的损伤趋势突出在急性期，而血运再通可以保护神经损伤。

　　5  实验局限性

    发生梗死病变后，没有监测血浆及不同部位心肌组织，NE及儿茶酚胺等激素的变化，所以对结果有影响。

【】
  　　［1］林国成，乔宏庆，侯英萍，等.抗CMmAb杂交瘤细胞系的建立及对心肌梗死动物模型的放射免疫显像［J］.细胞与分子免疫学杂志，1998，14(1)：71.

　　［2］周谊，马福成，乔宏庆，等.亚急性心肌梗死与心肌细胞活性的实验性研究［J］.临床康复，2004，8(6)：1042?1044.

　　［3］Mathes P,Cowan C,Gudbjarnason S. Storage and metabolism of norepinephrine after experimental myocardial infarction［J］. Am J Physiol，1971，20:27?32.

　　［4］Sanbe A, Takeo S. Long?term treatment with angiotensin I?converting enzyme inhibitors attenuates the loss of cardiac adrenoceptor responses in rats with chronic heart failure［J］. Circulation，1992:2666?2675.

　　［5］Zelis R, Clemson B. Regulation of tissue noradrenaline in the rat myocardial infarction model of chronic heart failure［J］. Cardiovasc Res，1992，26:933?938.

　　［6］Minardo JD. Scintigraphic and electrophysiological evidence of canine myocardial sympathetic denervation and reinnervation produced by myocardial infarction or phenol application［J］. Circulation，1988，78(4):1008?1019.

　　［7］Sisson JC, Lynch JJ. Scintigraphic detection of regional disruption of adrenergic neurons in the heart［J］. Am Heart J，1988，116(1 Pt 1):67?76.

　　［8］Iwasaki T, Suzuki T. Dual?tracer autoradiography with thallium?201 and iodine?125?metaiodobenzylguanidine in experimental myocardial infarction of rat［J］. J Nucl Med，1996，37(4):680?684.

　　［9］Sakata K.Cardiac sympathetic dysfunction contributes to left ventricular remodeling after acute myocardial infarction［J］. Eur J Nucl Med，2000，27(11):1641?1649.

　　［10］Michael W. Acute and chronic effects of transient myocardial ischemic on sympathetic nerve activity,density,and norepinephrine content［J］. Cardiovascular research，1995，30(2)：270?280.