脱落细胞学涂片HE染色脱色后行免疫细胞化学染色的探讨
【关键词】 细胞学；HE染色；免疫细胞
体腔（包括胸腔、腹腔和心包腔）的浆膜面是肺、胃肠道和卵巢恶性肿瘤常见的转移部位，常伴积液。所以胸腹水脱落细胞的检测意义重大，已成为病理诊断的常规。在日常工作中经常发现HE染色的涂片中转移的腺癌细胞与增生的间皮细胞难以鉴别，为了进一步明确诊断，我们尝试用低浓度盐酸乙醇脱色并草酸漂白的方法对有可疑恶性瘤细胞的涂片进行免疫细胞化学标记，并取得了较好的效果,现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料
收集滨州医学院附属2005年1月至2007年4月新鲜胸腔积液156例，腹水标本143例和心包积液7例。患者年龄15岁~84岁，平均年龄59.3岁。其中男性159例，女性147例。306例体腔积液容量10 ml~500 ml，呈淡黄色或淡红色，澄清或浑浊。2%草酸水溶液；1% 的盐酸酒精溶液；即用型二步法免疫组化Envion染色试剂盒及鼠抗人一抗CEA、BerEP4、calretinin、Desmin均为迈新试剂公司产品。
1．2 方法
收集新鲜的体腔液，取其底部标本50 ml倒入离心管，2 000 r/min,15 min，弃上清。若为血性液体，可加入等量2%的冰乙酸，充分混匀再离心，沉淀物作涂片4张，95%的乙醇固定。
1．2．1 常规细胞学检查
将固定好的涂片行HE染色，树胶封固。细胞学检查结果分为三种：找到癌细胞、找到异性细胞和未找到癌细胞或异型细胞。本实验体腔积液共306例，找到癌细胞45例，找到异型细胞36例，未找到癌细胞或异型细胞的225例。
1．2．2 HE涂片褪色
对HE染色有可疑恶性细胞的涂片各1张用钻石笔刻号后装入染色架并泡入二甲苯Ⅰ10 min（如盖玻片不能自动滑落可适当延长时间）。去掉盖玻片，将涂片泡入二甲苯Ⅱ 5 min；二甲苯Ⅲ5 min；无水乙醇Ⅰ3 min；无水乙醇Ⅱ3 min；95%乙醇1 min；70%乙醇1 min；自来水稍洗；1%盐酸酒精脱色，镜下控制至切片几近无色，约需5 min；2%草酸水溶液浸泡 3 min～5 min；自来水稍洗，蒸馏水洗3 min。
1．2．3 免疫细胞化学检查
褪色后的涂片经蒸馏水洗后3%的H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，室温15 min~20 min。根据须标抗体的数量用免疫组化油笔将涂片划分成几个区域，并分别滴加相应的一抗CEA、Desmin、Ber?EP4 、calretinin（均为迈新公司产品），室温下孵育2 h。Envision+/HRP（迈新公司）室温下孵育30 min。DAB显色。Mayer苏木素对比染色。以TBS缓冲液为一抗作为阴性对照，以大网膜组织切片的间皮细胞作为阳性对照。
2 结果
36例含有异性细胞的褪色涂片行免疫细胞化学染色，其中癌细胞CEA和BerEP4共同阳性的19例，单独CEA+7例，单独BerEP4+4例。阳性信号定位准确，背景清晰。36例找到异型细胞的病例经免疫细胞化学染色证实29例为癌细胞，5例为增生的间皮细胞，并得到组织病检查证实。其中有2例经免疫细胞化学染色仍不能判断其良恶性。36例有可疑细胞的涂片均含有不同数量的间皮细胞，其中Calretinin阳性率达100%（15/15），Desmin阳性率为93.3%（13/15）,与［1］报道基本相同。
3 讨论
细胞学诊断大多数情况下只有在观察常规染色片后，才能决定是否需要进行免疫细胞化学染色，此时涂片已染色并无剩余白片，即使有剩余白片，也不能完全保证2张涂片中细胞的一致性。另外，体腔积液检查病例很多，本组实验采用306例，而经H?E染色发现有可疑瘤细胞的并不是太多，只有36例，占总例数的11.7%。如果每例积液都在涂片时预留白片，那么势必造成人力物力的浪费。文献报道将体腔积液制成细胞蜡块，虽有背景清晰，可重复切片等优势，但有时液体量比较少，离心后细胞数量少，涂片后剩余沉淀物已不能满足制作细胞块的需要，而且制作细胞块周期较长。所以对H?E染色发现有可疑恶性细胞的涂片褪色后行免疫细胞化学标记，不仅对明确诊断有所帮助，而且为科室节约开支。血性积液中红细胞及蛋白含量高，往往出现背景着色过度，而且蛋白质聚集在细胞周围，易阻止细胞的免疫反应。本组实验在处理血性胸腹时，首先使用２％冰醋酸溶液将红细胞与黏液解消除， 既可有效保留充足的、能提供诊断的细胞，而且也保留了足够的肿瘤细胞抗原，阳性细胞膜或细胞质棕黄色，颜色鲜明， 背景清晰，易于结果判断。本实验还采用了盐酸酒精褪色草酸漂白的方法对已染涂片进行褪色，效果理想。以往多种脱色剂应用于HE切片的脱色，其中酸性高锰酸钾［2］氧化并草酸漂白被认为是广泛采用较优良的脱色方法。但是，经过我们反复实践，应用于脱落细胞涂片并不适宜，因为高锰酸钾属于强氧化剂，与细胞作用剧烈。在高锰酸钾的作用下，很容易导致细胞的部分或完全脱落。而选用低浓度盐酸乙醇作脱色剂，作用比较温和，涂片可以褪色干净并保持细胞完整。采用盐酸乙醇作为脱色剂，其原理类似于常规HE 染色中的分化作用。盐酸可使留在细胞上的金属根（即苏木精染液中的媒染剂通常是钾明矾）与细胞分离，并阻止苏木精染料［3］色素根与媒染剂中的铝化台形成蓝紫色沉淀色素。草酸具有漂白作用，而且酸能破坏苏木精的醌型结构，使色素［4］与组织解离。从而达到脱色漂白作用。综上所述，我们认为应用低浓度盐酸乙醇脱色并草酸漂白的方法对已染涂片进行免疫细胞化学标记，简便可靠，效果理想。
【文献】
［1］邬万新，张燕萍，唐正英，等.Desmin标记对体腔积液中间皮细胞的诊断价值［J］.临床与实验病理学杂志,2005,21(5)：10.
［2］张谷，冯文华，鲁萍.原HE切片脱色后行免疫组织化学染色的探讨［J］.浙江肿瘤，1994，4：21?22.
［3］Culling CFA.组织病理学与组织化学技术手册［M］.北京：出版社，1982：242?243.
［4］王泊沄，李玉松，黄高昇，等.病理学技术［M］.北京：人民卫生出社，2000：128?134.
