维生素C抑制甘露醇诱导的血管内皮细胞凋亡的实验研究

           作者：潘开宇，尚世强，戴晓娜，叶志弘

【关键词】  维生素C;凋亡;血管内皮细胞;甘露醇

　　［摘要］目的: 探讨维生素C对甘露醇引起血管损伤及其诱导的血管内皮细胞凋亡基因表达的影响。 方法: （1）动物实验:将健康大白兔随机分4组，A组在兔耳缘静脉注射甘露醇;B、C、D组分别以生理盐水、维生素C、维生素E预处理后再静脉推注甘露醇，电镜、光镜下观察局部血管的损伤。（2）利用Biostar H-40s型芯片，检测甘露醇分别在应用三种保护剂前后对凋亡基因表达的影响。 结果: （1）动物实验:血管损伤程度上，A组为重度;B组为中～重度;D组为轻度;C组未见明显病理改变。（2）基因芯片检测:330条凋亡基因中，生理盐水组芯片无改变;维生素C组中45条促凋亡基因表达下调，34条抗凋亡基因表达上调;维生素E组3条促凋亡基因表达下调。 结论: 维生素C通过抑制血管内皮细胞凋亡而起到抑制甘露醇血管损伤的作用。

　　［关键词］ 维生素C;凋亡;血管内皮细胞;甘露醇
    
　　An experiment on inhibitive affection of vitamin C on the apoptosis of vascular endothelial cell induced by mannitol     
　　［Abstract］ Objective:To research the gene expressions of injury on blood vessel and vascular endothelial cell apoptosis induced by mannitol in us-ing vitamin C.Methods:（1）Animal experiment:healthy rabbits were randomized into4groups.Group A was injected with mannitol into the vein of the rabbit ear.Group B，group C，and group D，were injected first with NS，VitC and VitE respectively to pretreat the vessel，and then with mannitol.Electronic lens and optical microscope were used to observe the injury of blood vessel.（2）Arrays of type Biostar H-40s were used to test the changes of apoptosis gene expressions induced by mannitol before and after using protective agents.Results:（1）As for the degree of injury of the blood vessel，group Awas serious，group B was moderate to serious，and group D is slight.No pathological changes were observed in Group C.（2）All330apoptosis-related genes:in chips pretreated by normal saline，none was significantly different.In chips pretreated by vitamin C，45apoptosis genes were down-regulated，34anti-apoptosis genes were up-regulated.In chips pretreated by vitamin E，only3apoptosis genes were down-regulated.Conclusions:Vitamin C can protect vascular endothelial cell.

　　［Key words］Vitamin C;Apoptosis;Vascular endothelial cell;Mannitol
      
　　甘露醇是目前儿科临床使用最多的渗透性利尿剂，该药具肾毒性，也可引起静脉炎。报道静脉炎的产生是由于甘露醇通过激活炎症介质和有丝分裂素-活化蛋白激酶，直接引发血管内皮细胞凋亡所致［1］ ，但具体机制仍未明确。查文献可见维生素C抑制该凋亡的理论依据，而未见其具体实验报道。本研究采用在体和离体动物实验，观察不同预处理对甘露醇致家兔静脉内皮损伤的影响，以及诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响，探讨维生素C对甘露醇诱导的血管内皮细胞凋亡的作用。

　　1 材料和方法
   
　　1.1 动物实验
     
　　健康新西兰大白兔16只，随机分4组。在控制室温25℃的情况下，放置甘露醇溶液5h后实验。A组为对照组，在兔耳缘静脉推注20%甘露醇2.5mL.kg，静脉推注时间为5min。B、C、D组为实验组，分别以生理盐水2mL.kg、维生素C200mg.kg、维生素E100mg.kg预处理5min后再静脉推注甘露醇。静脉推注甘露醇36h后取标本，分别以静脉穿刺点为中心，活体切下边长为1cm的正方形耳廓组织，对半剪开，一半用10%的甲醛固定24h，常规病理切片，HE染色，光镜观察，另一半用2.5%戊二醛固定，脱水包埋，切片电镜观察。病理分析由未参加实验的病理科医生协助。观察指标包括:血管壁损害、血管周围出血、血管内淤血、炎性细胞浸润和纤维组织增生。依据全国统一静脉损伤病理组织学分级标准，将病变程度分轻、中、重三级。因每只动物双耳均同时利用，故每组相同类型标本各8个。

　　1.2 基因芯片技术
   
　　1.2.1 细胞培养和实验模型建立  取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，消化后以1.73×10 7 细胞量接种于培养皿中，培养液补至3mL。标本共4份，分别标以1、2、3、4号培养皿。1号为对照组，在2号培养皿中加入0.9%的生理盐水0.5mL;3号培养皿中加入终浓度为100μmol.L的维生素C注射液0.5mL;4号培养皿中加入终浓度为50μmol.L的维生素E乳剂0.15mL。30min后向1、2、3、4号培养皿中分别加入终浓度300mosm的甘露醇［2］ 1mL，37℃，5%CO 2 ，放置12h。

　　1.2.2 实验方法  （1）用常规方法进行样品总RNA的提取。（2）芯片制备:由博星基因公司提供部分基因，进行PCR扩增，经溶解、点样、干燥、UV交联及硼氢化钠液处理，晾干备用。基因芯片总点样数为4096个点，与凋亡相关的基因为330个，其中224个为促凋亡基因，106个为抗凋亡基因。（3）探针标记与杂交:用常规方法进行样品预杂交、探针标记、杂交、洗片，晾干后扫描。（4）检测和分析:芯片杂交结束后用Sca-nArray5000laser scanner在两个波长上进行激光扫描，获得的扫描图像用Gene Pix3.0软件进行分析，筛选出ratio大于2.0或小于0.5的数据项列于Filtereda工作表中。（5）生物信息学分析:通过internet进入美国国家医学图书馆的文献摘要库，网址为，搜索关于结果中所列差异表达基因的文献摘要或全文，分析这些基因的最新研究进展，探讨这些基因在细胞凋亡作用方面的意义。

　　2 结果
   
　　2.1 动物实验结果
   
　　2.1.1 光镜结果  A组标本均病变严重，可见血管壁纤维素样坏死，血管腔内血栓形成，见封三图1（A）;B组标本中均可见较严重病变，血管腔周围红细胞渗出，见封三图1（B）;C组标本中均可见基本正常兔耳血管结构，见封三图1（C）;D组标本中均可见轻度渗出、水肿，见封三图1（D）。
    
　　2.1.2 电镜结果  A组标本均可见静脉血管壁扩张、红细胞大量渗出、纤维组织增生、炎症细胞浸润，病变程度达重度，见封三图2（A'）;B组标本见血管腔周围红细胞渗出等中-重度病理改变，见封三图2（B'）;C组标本中可见基本正常兔耳血管，未见明显病理改变，见封三图2（C'）;D组标本见轻度血管侧壁破损、少量纤维素渗出等轻度病理改变，见封三图2（D'）。

　　2.2 基因芯片检测结果
   
　　2.2.1 4个样品总RNA的浓度和纯度测定  4个样 品RNA标本的OD 260 .OD 280 比值分别为:1.818、2.007、2.063、1.885，均大于1.7，符合RNA的实验要求。
    
　　2.2.2 实验组和对照组样品总RNA电泳结果  结果见封三图3，图中28S和18S条带均清晰，说明RNA无降解，可用于进一步实验。
    
　　2.2.3 检测和分析  封三图4为芯片不同样本（对照组.实验组）双色荧光标记叠加图。对照组用Cy3标记，实验组用Cy5标记。对照组和实验组二者经叠加后，黄点代表基因表达在对照组和实验组中无显著差异，红点代表基因表达水平明显升高，绿点代表基因表达水平有所下降。

   
　　封三图5系散点图，代表Cy3（对照组）和Cy5（实验组）荧光信号比值的离散程度。每个点的Y轴为Cy5的杂交信号相对强度，X轴为Cy3的杂交信号相对强度。45度角直线上的点Cy5.Cy3比值为1，表示无差异表达，远离45度角直线上的点为差异表达基因，越靠近X轴或Y轴表明该点基因差异表达越显著。
   
　　利用基因芯片技术，筛选出Cy5.Cy3比值大于2.0或小于0.5的差异基因。ratio值<0.5代表基因表达下调，在0.5～2.0之间代表基因表达无显著差异，>2.0代表基因表达上调。检测结果表明，在330条凋亡相关基因中，经生理盐水预处理的芯片上未发现此类基因表达发生改变;经维生素C预处理后有79条表达发生改变，其中45条促凋亡基因表达下调，34条抗凋亡基因表达上调;经维生素E预处理的芯片上发现3条促凋亡相关基因表达下调。330个点中有14个点最为重要，已被证实由甘露醇诱导，分别为:视紫红质抑制蛋白、表皮生长因子受体、蛋白酪氨酸磷酸酶、膜内陷素、ATP-结合序列、热激蛋白、粘连蛋白、微管蛋白、肿瘤坏死因子、线粒体核糖酶、T细胞激活核因子、整合素、N-钙粘蛋白、钙通道。在维生素C预处理芯片中此14个基因均明显下调，在维生素E预处理芯片中仅视紫红质抑制蛋白下调。表明经维生素C预处理可有效干预甘露醇诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，经维生素E预处理可轻微抑制细胞凋亡。
    
　　3 讨论
    
　　基因芯片是20世纪90年代起来的一项前沿生物技术，也叫DNA微阵列，是通过复杂的物理或化学方法，将大量的已知序列的DNA片断有规则地固定在约1cm 2 的支持物上（玻璃、硅等），从而检测特定的基因序列的一项技术。本研究所使用的Biostar H-40s表达谱芯片包含了4096个人靶基因cDNA克隆，主要基因包括细胞凋亡相关的蛋白、细胞周期蛋白类、DNA合成和修复、DNA结合、转录和转录因子、细胞信号和传递蛋白等。为减少实验引起的误差，芯片均重复制作，根据报道，基因芯片假阳性率为3%［3］ ，因此，做了重复实验后假阳性率下降到3%×3%=0.09%，基本上可排除实验引起的误差。
   
　　甘露醇作为儿科重要的脑水肿药物，在临床具有重大的应用价值。但在如何防治其引起的静脉炎方面，目前尚无统一的措施。本研究动物实验结果表明，维生素C预处理可有效阻止其静脉炎的发生。基因芯片技术发现，经维生素C预处理后，在330个凋亡基因中，45个促凋亡基因表达下调，34个抗凋亡基因表达上调。表明维生素C预处理可有效干预甘露醇诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。
   
　　45个表达下调的基因均被证实为促凋亡基因，其中有14个点最为重要，已被证实可由甘露醇诱导，如:表皮生长因子受体（0.204）在甘露醇等高渗物质作用下，可出现三个活性高峰，同时伴有Jun NH2-终末激酶、细胞外信号调节蛋白激酶、ERK1和ERK2、P38有丝分裂蛋白激酶表达上调［4］ ，通过激活PI3K-AKT和MEK-ERK途径来诱导细胞发生凋亡。蛋白酪氨酸磷酸酶（0.243）在甘露醇等高渗物质的作用下可受到较为持久的激活而出现表达上调［5］ ，并通过激活蛋白激酶C，与蛋白酪氨酸激酶的磷酸化和脱磷酸化过程一起参与非特异性凋亡信号转导。热激蛋白（0.344）在甘露醇等高渗物质刺激的早期阶段即可受到诱导，HSP70mRNA的积累提示HSP70基因的优先上调［6］ 。34个表达上调的基因均被证实为抗凋亡基因，如有丝分裂活化激酶（2.046）可通过抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase3，凋亡途径中的执行酶）的活性来达到抗凋亡作用［7］ ;白介素8（6.482）可通过促进细胞增生、介导抗凋亡信号而起到抗细胞凋亡的作用［8］ ;磷酸二酯酶（6.816）可通过抑制细胞内cGMP浓度（cGMP浓度持续升高可通过延长细胞周期使细胞生长受抑制并引起凋亡）而起到抗凋亡作用［9］ 。维生素C可增强此类抗凋亡基因的作用机制尚需进一 步的研究。

　　文献:
    
　　［1］Malek AM，Goss GG，Jiang L，et al.Mannitol at clinical concen-trations activates multiple signaling pathways and induces apoptosis in endothelial cells［J］.Stroke，1998，29（12）:2631-2640.
   
　　［2］ Hee，Jin，Kwak，et al.Angiopoietin-1Inhibits Irradiation-and Mannitol-Induced Apoptosis in Endothelial Cells［J］.Circulation，2000，101（19）:2317.
   
　　［3］ Wang K，Gan L，Jeffery E，et al.Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray［J］.Gene，1999，229:101-108.
   
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　　［5］ Droillard M，Boudsocq M，Barbier-Brygoo H，et al.Different protein kinase families are activated by osmotic stresses in Arabi-dopsis thaliana cell suspensions.Involvement of the MAP kinases At MPK3and AtMPK6［J］.FEBS Lett，2002，527（1-3）:43-50.
   
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　　［8］Ryningen A，Wergeland L，Glenjen N，et al.In vitro crosstalk between fibroblasts and native human acute myelogenous leukemia（AML）blasts via local cytokine networks results in increased pro-liferation and decreased apoptosis of AML cells as well as increased levels of proangiogenic Interleukin8［J］.Leuk Res，2005，29（2）:185-196.
   
　　［9］Zhu B，Vemavarapu L，Thompson WJ，et al.Suppression of cy-clic GMP-specific phosphodiesterase5promotes apoptosis and in-hibits growth in HT29cells ［J］.J Cell Biochem，2005，94（2）:336-350.